元沙沙 馬 燕 吳南楠 許月超 楊龍艷 柯 靜 趙 冬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心 糖尿病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149)

葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)作為一種葡萄糖傳感器，在胰腺β細(xì)胞的葡萄糖代謝和胰島素分泌中起著重要的作用[1]。GCK突變與胰島素分泌和肝糖原合成的缺陷有關(guān)，導(dǎo)致胰腺對(duì)葡萄糖的感受性下降，出現(xiàn)輕度慢性高血糖、糖耐量受損或糖尿病，這種糖尿病稱為青少年發(fā)病的成年型糖尿病2型(maturity onset diabetes of the young 2, MODY2)，又稱葡萄糖激酶基因突變型青少年起病的成年型糖尿病(glucokinase-maturity onset diabetes of the young,GCK-MODY)，主要表現(xiàn)為輕度、持續(xù)性的、穩(wěn)定性的高空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，并以常染色體顯性遺傳的方式遺傳[2]， MODY2患者一般無(wú)須口服藥物或使用胰島素，通過(guò)控制飲食及增加運(yùn)動(dòng)即可穩(wěn)定血糖。但由于其表型隱匿，無(wú)明顯惡性臨床后果，除基因檢測(cè)之外，難以尋找其獨(dú)特的臨床特征，易被誤診為1型或者2型糖尿病，造成不必要的胰島素或者口服降糖藥治療， MODY2的診斷標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)GCK基因測(cè)序，但對(duì)于中國(guó)龐大的糖尿病人群，對(duì)所有可疑患者進(jìn)行基因測(cè)序是不現(xiàn)實(shí)的。探索一種更有效的MODY2篩查機(jī)制來(lái)識(shí)別GCK突變患者是十分必要的。本研究結(jié)合現(xiàn)有的MODY2的臨床特點(diǎn)，制定了空腹靜脈血糖聯(lián)合血清三酰甘油的新標(biāo)準(zhǔn)，在妊娠期血糖異常人群中進(jìn)行MODY2糖尿病篩查。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年1月1日至2018年12月31日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢和分娩的婦女。受試者在孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)及孕后期(28周至分娩)3個(gè)時(shí)期均進(jìn)行了空腹血糖、血清三酰甘油的檢查；孕期24～28周進(jìn)行口服75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)，孕期未進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)者不予排除。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕期空腹靜脈血糖及血清三酰甘油檢查資料不全；嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病如腫瘤患者；孕前已有明確糖尿病應(yīng)用胰島素或口服降糖藥治療者；不同意參加本研究者。由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員對(duì)受試者隨訪進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查、體格檢查，并告知葡萄糖激酶基因檢測(cè)的目的和方法，患者知情、理解并同意后，簽署《GCK基因檢測(cè)知情同意書(shū)》。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)定，該項(xiàng)研究的所有方法學(xué)，涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)方面的問(wèn)題符合赫爾辛基宣言的要求(倫理審查批件號(hào)：2014-KS-011)。

1.2 研究方法

1.2.1 葡萄糖激酶突變篩查條件

GCK基因突變患者的空腹靜脈血糖通常高于5.5 mmol/L[3]，而OGTT試驗(yàn)2 h血糖增量通常在3.0～4.6 mmol/L[4]，而患者的血清三酰甘油常低于1.43 mmol/L[5]。因此，本研究中本課題組制定了符合GCK基因突變篩查條件：孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)及孕后期(28周至分娩)3個(gè)時(shí)期空腹血糖檢查，均≥5.5 mmol/L；且至少有1次血清三酰甘油≤1.43 mmol/L；孕期24～28周口服75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)者2 h血糖增量<4.6 mmol/L，孕期未進(jìn)行OGTT試驗(yàn)者不予排除。對(duì)于滿足上述3條標(biāo)準(zhǔn)的受試者進(jìn)行GCK基因測(cè)序，并采集其一般資料如年齡、身高、孕前體質(zhì)量、一級(jí)親屬糖尿病家族史，是否應(yīng)用降糖方案等。

1.2.2GCK基因突變檢測(cè)

采用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿法從符合GCK檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的受試者外周血中提取DNA樣本并于-80 ℃冰箱中存儲(chǔ)。利用PCR 擴(kuò)增技術(shù)捕獲外顯子，經(jīng)ABI3730 對(duì)所選樣本進(jìn)行Sanger 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件子程序SeqMan軟件分析，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)基因變異分級(jí)體系對(duì)疑似致病突變分級(jí)，同時(shí)對(duì)未見(jiàn)報(bào)道的突變或者是臨床意義不明確的突變進(jìn)行軟件預(yù)測(cè)及群體數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。GCK基因外顯子的PCR所用引物詳見(jiàn)表1。

表1 葡萄糖激酶基因擴(kuò)增及測(cè)序引物

GCK: glucokinase;F：forward primer;R：reverse primer.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果

本研究共對(duì)2 454名受試者進(jìn)行篩查，其中滿足孕期3次FBG均≥5.5 mmol/L，至少有1次三酰甘油≤1.43 mmol/L者，且滿足OGTT試驗(yàn)2 h血糖增量<4.6 mmol/L的受試者12例，陽(yáng)性率為0.49%。實(shí)際獲得符合GCK基因篩查條件患者的外周血DNA樣本5例，測(cè)得GCK基因突變者1例，未突變者4例。進(jìn)行GCK測(cè)序者的臨床特征詳見(jiàn)表2。

表2 進(jìn)行GCK測(cè)序者的臨床資料

患者B為GCK基因突變患者，首次就診年齡為29歲，具有糖尿病病史7年，一級(jí)親屬中有糖尿病家族史，孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為26.4 kg/m2?；颊弑敬尉驮\的空腹血糖為7.25 mmol/L，三酰甘油為0.81 mmol/L，均符合GCK基因突變患者的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 GCK基因測(cè)序結(jié)果

GCK基因突變患者的測(cè)序結(jié)果詳見(jiàn)圖1(雙峰處為堿基突變位點(diǎn))。參比序列為NM_033507，NP_277042。突變區(qū)域：c.784G>A,p.G262R,rs104894008。

圖1 GCK突變患者測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing result of patients with GCK mutationGCK: glucokinase

3 討論

本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)孕期空腹血糖與三酰甘油，篩選出MODY2患者，并進(jìn)行了基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1例GCK基因突變引起的MODY2，其突變符合經(jīng)典的MODY2致病位點(diǎn)[6]。GCK突變引起的MODY2糖尿病在各個(gè)地區(qū)和人種中的發(fā)病率差異較大，中國(guó)人群中MODY2糖尿病的患病率初步估計(jì)為0.4%，中國(guó)妊娠期血糖異常人群中GCK最小突變率為0.27%[7-8]。而在所有的MODY糖尿病家系中，MODY2患病率高達(dá)10.4%[9]。此外，GCK突變也是造成兒童時(shí)期高血糖的主要原因。迄今為止，關(guān)于我國(guó)GCK突變的真實(shí)患病率，仍舊存在爭(zhēng)議。最新研究[5]表明MODY2在自然人群和糖尿病患者中的患病率分別為0.21%和1.3%。由于我國(guó)人口基數(shù)龐大，初步估計(jì)我國(guó)自然人群中的MODY2患病人數(shù)為273萬(wàn)，因此不能忽略潛在的龐大MODY2人群。本研究中的MODY2患者曾被誤診為2型糖尿病合并妊娠，孕期應(yīng)用胰島素控制血糖。錯(cuò)誤的診斷增加了患者額外的治療花費(fèi)、心理負(fù)擔(dān)以及藥物不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。目前診斷MODY2的方法并不簡(jiǎn)單，大規(guī)模的基因測(cè)序由于不可避免的經(jīng)濟(jì)成本而難以推廣。經(jīng)典的MODY篩查臨床標(biāo)準(zhǔn)包括以下特點(diǎn)：非肥胖患者，缺乏自身抗體證據(jù)，家族中父母至少有一方起病年齡小于25歲，至少三代連續(xù)的糖尿病家族史[10]。國(guó)際上MODY2患者的核心臨床特征為自然人群：①空腹血糖≥5.5 mmol/L(98%)，且為持續(xù)性(至少3次獨(dú)立發(fā)生的)和穩(wěn)定性的(持續(xù)幾個(gè)月或幾年)[11]。②糖化血紅蛋白稍高于正常水平但很少超過(guò)7.5%。③OGTT增加幅度(OGTT 2 h減空腹血糖)較小(71%的患者小于3 mmol/L)，98%的患者小于4.6 mmol/L)。④父母被診斷為“2型糖尿病”，至少一方的空腹血糖會(huì)輕微升高(5.5～8.0 mmol/L)，但無(wú)合并癥，或不是糖尿病患者。妊娠人群[12-13]：①懷孕前、懷孕中、懷孕后持續(xù)性升高的空腹血糖(5.5～8 mmol/L)。②至少1次OGTT血糖差值小于4.6 mmol/L(孕期或者懷孕后)。③父母可能會(huì)有輕微的2型糖尿病，但家族史缺失患者不應(yīng)排除診斷。④孕前體質(zhì)量指數(shù)小于25 kg/m2可提高診斷效率。近年來(lái)，研究[14-16]顯示較低濃度的三酰甘油也是MODY2的特點(diǎn)之一。

結(jié)合現(xiàn)有國(guó)內(nèi)的MODY2的特征，制定出了符合中國(guó)人群特點(diǎn)的GCK突變篩查策略：以孕早期(1～12周)、孕中期(13～27周)、孕后期(28周至分娩)3個(gè)時(shí)期空腹血糖檢查，至少3次均≥5.5 mmol/L，且至少有1次三酰甘油≤1.43 mmol/L；孕期24～28周口服75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)者2 h增量<4.6 mmol/L，孕期未進(jìn)行OGTT試驗(yàn)者不予排除。并且中國(guó)的晚婚晚育及計(jì)劃生育關(guān)于第二胎政策的調(diào)整，決定了中國(guó)人群的生育年齡普遍增加，因此發(fā)病年齡<25歲也不作為本研究推薦的篩選標(biāo)準(zhǔn)。最終，本研究根據(jù)GCK篩選標(biāo)準(zhǔn)在研究人群中檢測(cè)出1名MODY2患者。該患者為年輕育齡期女性，首次分娩年齡23歲，身高157 cm，孕前BMI<25 kg/m2，首次孕期被診斷為妊娠期糖尿病，建議應(yīng)用胰島素治療，但血糖控制不佳，未進(jìn)一步明確基因分型檢查。由患者資料分析，可見(jiàn)該患者符合MODY2的一些基本特征：發(fā)病年齡早，通常小于25歲(該患者初診年齡為23歲)；BMI通常小于25 kg/m2；家族中一級(jí)親屬有糖尿病病史；空腹血糖濃度輕度升高，通常在5.5～8.3 mmol/L之間，并且多年無(wú)惡化進(jìn)展，糖化血紅蛋白小于7.5%。

本研究存在自身的局限性：①由于樣本來(lái)源于回顧性研究數(shù)據(jù)，因此對(duì)患者的隨訪十分關(guān)鍵，一定比例的失訪導(dǎo)致本研究缺乏一些樣本，因此這一結(jié)論需要在大規(guī)模的研究中證實(shí)。②由于缺乏足夠的陽(yáng)性病例，很難評(píng)估篩選方法的效率。與其他人群中發(fā)病率差異類(lèi)似，妊娠期血糖異常人群中GCK突變檢出率的差異可能與地區(qū)、種族、人群的基數(shù)、GCK患者篩查標(biāo)準(zhǔn)等因素有關(guān)。不同研究中的篩選方法不同，得出的結(jié)論[8]也存在差異，就中國(guó)妊娠人群而言，與往期的研究結(jié)論是一致的。③與以往研究中使用的標(biāo)準(zhǔn)相比，未使用糖化血紅蛋白對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行限制，因此目標(biāo)人群相對(duì)于以往研究[17]是增加的，這也是GCK突變的發(fā)生率低的一大原因。

本研究中基于3次空腹血糖和三酰甘油的嚴(yán)標(biāo)準(zhǔn)篩選方法，對(duì)于篩查中國(guó)人群中的MODY2是可行的。盡管有研究提出MODY2患者的血脂并未發(fā)現(xiàn)明顯異常，但在中國(guó)，低三酰甘油確實(shí)是MODY2患者的真實(shí)表現(xiàn)。中國(guó)妊娠期血糖異常人群中GCK突變發(fā)病率低，假設(shè)未被送檢的人群中GCK基因均無(wú)突變，那么估計(jì)中國(guó)人群中的 MODY2患病率約為1/2 454，約等于0.4‰，這個(gè)結(jié)論與以往研究[17]大致相符。因此筆者認(rèn)為，GCK突變不是孕期血糖異常的主要致病原因。但由于中國(guó)人口眾多，這些人是不可忽視的。正確的篩查和診斷將有利于節(jié)約醫(yī)療資源，提供產(chǎn)前咨詢，提高患者的生活質(zhì)量。