孟金柱，安清明，武淵勛，趙園園

(1.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300;2.山西普源泰奶牛養(yǎng)殖有限公司，山西 晉中 030800)

哺乳動(dòng)物的卵泡是生殖系統(tǒng)的重要組成部分，它在控制發(fā)情周期、發(fā)情行為，確保卵母細(xì)胞發(fā)育能力及后期胚胎存活率、排卵后黃體功能和孕酮合成等方面起著重要作用[1]。在牛的1個(gè)發(fā)情周期中，卵泡生長(zhǎng)特征呈現(xiàn)波的模式，常常會(huì)出現(xiàn)2～3個(gè)卵泡波[2]。直徑4～9 mm的有腔卵泡生長(zhǎng)依賴于卵泡刺激素(FSH)，且在卵泡發(fā)育波出現(xiàn)之前，F(xiàn)SH濃度會(huì)發(fā)生短暫升高[3]。研究表明，牛卵泡內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子，如激活素、抑制素和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)及其結(jié)合蛋白等，在調(diào)控卵泡中細(xì)胞的存活、增殖或凋亡過(guò)程中發(fā)揮了很重要的作用[4]。

牛卵泡含有卵母細(xì)胞(CC)、顆粒細(xì)胞(GCs)和膜細(xì)胞(TCs)。顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞合成的類固醇和肽激素分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，發(fā)出一系列信號(hào)控制卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟，從而創(chuàng)造了一個(gè)決定卵母細(xì)胞質(zhì)量和成熟的微環(huán)境[5-6]。膜細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞色素P450 17A1酶(CYP17A1)合成雄激素[7]，而顆粒細(xì)胞中的細(xì)胞色素P450 19A1酶(CYP19A1)負(fù)責(zé)將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(E)[8]。增強(qiáng)雌二醇(E2)產(chǎn)生的能力，對(duì)維持優(yōu)勢(shì)卵泡(DF)的生長(zhǎng)和啟動(dòng)性行為、促性腺激素濃度的升高、減數(shù)分裂的恢復(fù)和排卵至關(guān)重要[9]。牛卵泡發(fā)育過(guò)程中E2的產(chǎn)生受多種激素和生長(zhǎng)因子調(diào)控，包括FSH[10]、IGF[11]、可卡因安非他命調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)[12]以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)[13]，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

多種動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已經(jīng)通過(guò)Illumina測(cè)序被發(fā)現(xiàn)，如綿羊[14]、奶牛[15]和豬[16]。ROMEREIM等[17]對(duì)牛卵泡中顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞、大黃體細(xì)胞(LLCs)和小黃體細(xì)胞(SLCs)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，篩選出促進(jìn)黃體形成及參與卵泡發(fā)育的相關(guān)基因。鑒于此，通過(guò)Illumina平臺(tái)對(duì)牛DF和從屬卵泡(SF)中的顆粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，篩選出卵泡發(fā)育相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因，對(duì)揭示牛特定的卵泡發(fā)育階段多種配體、受體和同源胞內(nèi)信號(hào)分子的表達(dá)差異，分析促進(jìn)牛卵泡顆粒細(xì)胞增殖及調(diào)控E2分泌的關(guān)鍵因子具有重要意義，為進(jìn)一步闡明調(diào)控優(yōu)勢(shì)卵泡被選擇的潛在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

以山西省太谷縣普源泰奶牛養(yǎng)殖有限公司的黑白花奶牛為研究對(duì)象，在相同的飼喂條件下，選取6頭2歲齡健康母牛，同期發(fā)情并使用B超檢測(cè)每頭牛卵泡發(fā)育情況，送往屠宰場(chǎng)屠宰，然后采集每頭牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)與第二大卵泡(5～8 mm)，置于4 ℃杜氏磷酸緩沖液(DPBS)中，帶回動(dòng)物繁殖生理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 DF和SF的篩選 將采集到的6頭牛的最大卵泡與第二大卵泡分別放到6個(gè)盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，抽取卵泡液并使用ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)測(cè)定E2和孕激素(P)，根據(jù)最大卵泡和第二大卵泡卵泡液中E2和P的比值篩選出DF和SF，分別刮取其中的顆粒細(xì)胞。

1.2.2 總RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 用RNA微量提取試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))提取3頭牛DF和SF顆粒細(xì)胞中的總RNA并純化，使用Agilent Bioanalyzer 2100檢測(cè)總RNA的完整性，Qubit 2.0 Flurometer測(cè)量濃度后，由北京諾和致源生物信息科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、Illumina測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及分析 將Illumina測(cè)序獲得的原始reads去除質(zhì)量低的、含N的、接頭等序列后，獲得干凈reads。干凈序列從頭組裝后得到unigenes序列，同時(shí)使用SOAP V2.0軟件將其比對(duì)到牛的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，此時(shí)獲得mRNA。使用DESeq 2對(duì)獲得的mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，同時(shí)篩選出牛卵泡發(fā)育相關(guān)上調(diào)表達(dá)基因。用DAVID軟件對(duì)獲得的上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO分析及KEGG信號(hào)通路分析。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄及引物合成 將Illumina測(cè)序剩余的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行功能分析后，篩選6個(gè)可能與牛卵泡發(fā)育相關(guān)的基因，使用NCBI設(shè)計(jì)引物(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 供試引物序列Tab.1 Primer sequences for test

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)牛DF與SF顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)上調(diào)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)，根據(jù)TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Mix 10 μL，H2O 5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-△△CT法計(jì)算，經(jīng)SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛DF和SF篩選結(jié)果

參照文獻(xiàn)[17]中篩選DF和SF的方法(最大卵泡卵泡液中E2/P>1，第二大卵泡卵泡液E2/P<1)，對(duì)每頭牛的最大卵泡和第二大卵泡卵泡液中E2和P進(jìn)行測(cè)定，篩選出3頭牛的DF和SF(表2)。后續(xù)試驗(yàn)采用這3頭牛的DF和SF顆粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。

表2 牛DF和SF卵泡液中E2和P的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of E2 and P in DF and SF follicular fluid in cattle

2.2 牛卵泡顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)基因篩選

將測(cè)序結(jié)果與牛的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得32 346個(gè)基因，分別將DF和SF顆粒細(xì)胞中的FPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其中FPKM≥0.5的基因有13 243個(gè)。使用DESeq 2軟件對(duì)獲得的13 243個(gè)高表達(dá)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，共得到194個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，表3列出了其中差異表達(dá)倍數(shù)最高的20個(gè)基因及其功能。

表3 牛DF和SF顆粒細(xì)胞中差異倍數(shù)最高的20個(gè)基因Tab.3 Top 20 genes of fold change between DF and SF GCs in cattle

續(xù)表3 牛DF和SF顆粒細(xì)胞中差異倍數(shù)最高的20個(gè)基因Tab.3(Continued) Top 20 genes of fold change between DF and SF GCs in cattle

2.3 牛卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)基因GO及KEGG分析

通過(guò)對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，從而對(duì)可能促進(jìn)卵泡發(fā)育的基因進(jìn)行分類。應(yīng)用DAVID軟件對(duì)獲得的194個(gè)表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行GO分析,共分為3大類33組，其中參與生物學(xué)過(guò)程(Biological process)的基因占60.6%；與細(xì)胞組分(Cellular component)有關(guān)基因占21.2%，其中31個(gè)基因參與細(xì)胞質(zhì)功能；與分子功能(Molecular funtion)相關(guān)的基因占18.2%，其中18個(gè)基因參與金屬離子結(jié)合(表4)。

為了進(jìn)一步得到促進(jìn)卵泡發(fā)育有關(guān)基因的信號(hào)通路，使用DAVID軟件對(duì)表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共發(fā)現(xiàn)4條通路(表5)，其中基因富集最為顯著的是軸突導(dǎo)向通路。

表4 牛DF和SF顆粒細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)基因GO分析Tab.4 GO analysis of up-regulated genes in DF and SF GCs in cattle

續(xù)表4 牛DF和SF顆粒細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)基因GO分析Tab.4(Continued) GO analysis of up-regulated genes in DF and SF GCs in cattle

表5 上調(diào)表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路分析Tab.5 KEGG pathway analysis of up-regulated genes

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

通過(guò)對(duì)篩選出來(lái)的6個(gè)具有代表性的上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果(圖1)表明，CYP19A1

**和*分別表示在P<0.01和P<0.05水平上差異顯著** and *represent significant difference at P<0.01 and P<0.05,respectively圖1 候選上調(diào)表達(dá)基因在牛DF和SF顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of candidate up-regulated genes between DF and SF GCs in cattle

在DF顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于SF(P<0.01)，TXNIP、BEX2和PRSS35在DF顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于SF(P<0.05)，與Illumina測(cè)序表達(dá)趨勢(shì)一致。EIF4EBP1和CHST11在DF和SF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)與Illumina測(cè)序結(jié)果相反，但差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

哺乳動(dòng)物在發(fā)育過(guò)程中，卵巢上最大的卵泡，即未來(lái)的優(yōu)勢(shì)卵泡持續(xù)生長(zhǎng)、成熟并排出卵子[18]。有腔卵泡的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為通過(guò)在時(shí)間和空間上的有序組織來(lái)促進(jìn)對(duì)促性腺激素的響應(yīng)，這首先導(dǎo)致卵泡募集，并伴隨著卵泡波的出現(xiàn)，然后促進(jìn)優(yōu)勢(shì)卵泡生長(zhǎng)成為排卵卵泡[19]。研究表明，F(xiàn)SH和IGF-1等內(nèi)分泌因子是有腔卵泡發(fā)育的主要驅(qū)動(dòng)因素[20]。但在每個(gè)卵泡波中，促進(jìn)卵泡發(fā)育成為優(yōu)勢(shì)卵泡并排卵的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。AUSTIN等[21]的研究結(jié)果表明，在牛發(fā)情周期的第1個(gè)卵泡波中，閉鎖卵泡分泌E2的能力會(huì)減弱。ASSEY等[22]在研究?jī)?yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵泡液中雌激素在優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中占主導(dǎo)作用；從屬卵泡最終會(huì)走向閉鎖，卵泡液中主要是P占主導(dǎo)作用。本研究分別測(cè)定最大卵泡與第二大卵泡中E2和P的濃度，采取最大卵泡卵泡液中E2/P>1和第二大卵泡卵泡液中E2/P<1來(lái)確定優(yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡。

LI等[23]應(yīng)用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)水牛不同大小的卵泡(直徑小于5 mm、5～8 mm、8～12 mm及大于12 mm)顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，卵泡的成熟和排卵可能會(huì)受到免疫控制。本研究通過(guò)對(duì)牛的優(yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，獲得194個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。分別對(duì)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集、KEGG信號(hào)通路分析，從中篩選出6個(gè)基因，在牛的卵泡發(fā)育過(guò)程中可能會(huì)起促進(jìn)作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析結(jié)果顯示，CYP19A1在DF顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量極顯著地高于SF (P<0.01)，PRSS35、BEX2和TXNIP在優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著地高于從屬卵泡 (P<0.05)，與Illumina測(cè)序所得到的結(jié)果基本一致。

CYP19A1作為細(xì)胞色素 P450 超家族蛋白成員之一，在雄激素合成雌激素過(guò)程中起到了重要的催化作用。FSH促進(jìn)顆粒細(xì)胞表達(dá)CYP19A1，將膜細(xì)胞分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。BAO等[24]將小鼠CYP19A1基因敲除后發(fā)現(xiàn)，卵泡喪失了分泌雌激素的功能，但仍然能夠?qū)ν庠创萍に禺a(chǎn)生應(yīng)答。敲除掉CYP19A1基因的小鼠，卵泡發(fā)育止步于腔前卵泡，從而導(dǎo)致小鼠不能排卵[25]。WAHLBERG等[26]通過(guò)基因芯片技術(shù)研究與小鼠排卵相關(guān)的蛋白酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，PRSS35在排卵卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)量極高，對(duì)卵泡排卵以及黃體的形成和退化起了促進(jìn)作用。本研究中，PRSS35在牛DF中的表達(dá)量顯著高于SF，PRSS35作為上調(diào)基因促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，與WAHLBERG等[26]的研究結(jié)論相符。BEX2是BEX家族中重要的成員之一。ZHOU等[27]研究發(fā)現(xiàn)，BEX2可以促進(jìn)U251細(xì)胞的增殖，敲除BEX2則會(huì)導(dǎo)致U251細(xì)胞凋亡。MENG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，降低BEX2的表達(dá)會(huì)引起線粒體凋亡，從而使細(xì)胞周期阻滯于G1期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，TXNIP在DF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于SF，推測(cè)其可能會(huì)促進(jìn)卵泡的發(fā)育并導(dǎo)致排卵。

本研究在牛DF和SF顆粒細(xì)胞中共獲得194個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，結(jié)合功能分析，共篩選出6個(gè)卵泡發(fā)育相關(guān)上調(diào)的基因，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，CYP19A1、TXNIP、BEX2和PRSS35在牛DF顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平均比SF高，這些基因可能會(huì)促進(jìn)卵泡的發(fā)育，最終引起卵泡排卵。