周遇巧，郭國業(yè)，周 索，杜 戈，李書林

(1.南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061；2.河南省西峽獼猴桃研究所，河南 西峽 474573)

獼猴桃原產(chǎn)中國，是屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)的多年生藤本植物[1]。全世界現(xiàn)有約66種獼猴桃屬植物、118個(gè)分類單位(變種、變型)[1]，最新的分類系統(tǒng)研究將其劃分為54種、21個(gè)變種，共75個(gè)分類群[2-3]。研究表明，獼猴桃多數(shù)產(chǎn)于中國，中國被認(rèn)為是獼猴桃屬植物的起源、進(jìn)化和分布中心，獼猴桃集中分布于秦嶺以南、橫斷山以東的地域[3-4]。豐富的獼猴桃野生種質(zhì)資源為獼猴桃屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化研究、品種選育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了條件。

由于獼猴桃為雌雄異株植物，染色體倍性呈現(xiàn)多倍化，種間和品種間的雜交嚴(yán)重，導(dǎo)致遺傳背景錯(cuò)綜復(fù)雜，譜系親緣關(guān)系模糊不清，嚴(yán)重影響到獼猴桃種質(zhì)鑒定、品種改良和新品種的培育與開發(fā)利用。中華獼猴桃(Actinidiachinensis)和美味獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)存在較為廣泛的野外居群的重疊分布[5]，使得雜交后代存在豐富的基因型和表型。因此，加強(qiáng)對(duì)獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性與進(jìn)化的研究對(duì)獼猴桃種質(zhì)資源保護(hù)和利用以及新品種培育具有重要意義。起始密碼子多態(tài)性(Start condon targeted polymorphism，SCoT)是COLLARD等[6]根據(jù)植物基因組ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性而開發(fā)的一種目的基因分子標(biāo)記，其操作簡單方便，引物遺傳信息豐富，多態(tài)性好。目前，SCoT分子標(biāo)記已被成功應(yīng)用于菊花、地黃、桂花、梨等多種植物的遺傳多樣性研究，特別是在遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜建立等方面取得較多進(jìn)展[7-10]。在獼猴桃種質(zhì)資源多樣性研究方面，簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)等分子標(biāo)記已經(jīng)成功應(yīng)用于獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[11-13]，而應(yīng)用SCoT分子標(biāo)記的研究尚較少。陳伯倫等[14]利用SCoT分子標(biāo)記對(duì)17個(gè)獼猴桃品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性和變異鑒定，發(fā)現(xiàn)3個(gè)變異株系均與對(duì)照品種(紅陽和金桃)有一定的親緣關(guān)系，可以有效區(qū)分獼猴桃性狀變異。本研究運(yùn)用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)28份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為獼猴桃種質(zhì)關(guān)系鑒定、優(yōu)良基因型挖掘和保護(hù)、新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為美味獼猴桃、中華獼猴桃以及近緣種，共28份，分別來源于河南、陜西、貴州等地。其中，美味獼猴桃種質(zhì)包含米坪行上1號(hào)、寨根3號(hào)、實(shí)生2號(hào)等。中華獼猴桃種質(zhì)包含通山5號(hào)、華光2號(hào)、華光3號(hào)等。近緣種為大籽獼猴桃(A.macrosperma)、軟棗獼猴桃(A.arguta，雌、雄)。利用無菌水和75%乙醇，將采集的獼猴桃植株新鮮幼嫩葉片沖洗干凈，分別放置于裝有硅膠的采集袋中，保存于-20 ℃的冰箱。供試獼猴桃材料信息見表1。

表1 28份供試獼猴桃種質(zhì)的名稱及來源Tab.1 Name and origin of 28 tested Actinidia germplasms used in the experiment

1.2 基因組DNA提取

利用植物基因組DNA提取試劑盒，采用改良CTAB法提取獼猴桃基因組DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的樣品基因組DNA用核酸微量測定儀稀釋至一致濃度(50 ng/μL)，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SCoT-PCR反應(yīng)體系建立

參考袁王俊等[7]、和世玉等[9]和楊珂等[10]的SCoT-PCR方法并進(jìn)行探索，建立獼猴桃SCoT-PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序。SCoT-PCR的反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中2×TaqPlus Master Mix 10.0 μL、SCoT引物1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，退火50 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 引物篩選與SCoT-PCR擴(kuò)增

供篩選所用的55條SCoT分子標(biāo)記引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。隨機(jī)選取5個(gè)獼猴桃種質(zhì)的模板DNA，進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增。通過對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳多態(tài)性指紋圖譜檢測，最終篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性好、位點(diǎn)清晰的8條引物用于所有供試材料的遺傳分析。篩選出的引物信息如表2所示。采用篩選出的8條SCoT標(biāo)記引物對(duì)28份獼猴桃材料基于優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在核酸凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照、保存。

表2 篩選出的8條SCoT引物序列及其退火溫度Tab.2 The sequences of 8 screened SCoT primers and annealing temperatures

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)核酸多態(tài)性擴(kuò)增圖譜，以“0/1”統(tǒng)計(jì)SCoT擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立引物擴(kuò)增的“0/1”分子數(shù)據(jù)矩陣，并依據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換。采用POPGEN 32軟件計(jì)算SCoT引物擴(kuò)增的位點(diǎn)總數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分率。利用NTSYS軟件，計(jì)算獼猴桃種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)，基于遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA(Unweighted pair group method analysis)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT擴(kuò)增多態(tài)性分析結(jié)果

如表3所示，8條SCoT引物對(duì)28份獼猴桃種質(zhì)材料共擴(kuò)增出75條帶，平均每條引物擴(kuò)增出9.4條。其中，位點(diǎn)多態(tài)性條帶數(shù)為73條，平均每條引物擴(kuò)增出9.1條多態(tài)性條帶，位點(diǎn)多態(tài)性比率為97.3%，多態(tài)性范圍在88.9%～100.0%，顯示篩選的8條SCoT引物標(biāo)記具有較高的多態(tài)性。圖1為引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31對(duì)28份獼猴桃材料的SCoT標(biāo)記多態(tài)性擴(kuò)增圖譜。從擴(kuò)增結(jié)果來看，SCoT引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小主要分布在250～2 000 bp，不同引物在同一種質(zhì)材料中產(chǎn)生的位點(diǎn)信息存在差異，相同引物在不同種質(zhì)材料中的位點(diǎn)信息也存在差異，顯示供試的獼猴桃種質(zhì)材料在基因組DNA水平上具有明顯的差異。

表3 SCoT引物的擴(kuò)增多態(tài)性信息Tab.3 Amplification polymorphic information of SCoT primers

圖1 引物SCoT-14、SCoT-21和SCoT-31對(duì)28份獼猴桃種質(zhì)的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification fingerprint of 28 Actinidia germplasms with primer SCoT-14,SCoT-21,SCoT-31

2.2 獼猴桃種質(zhì)遺傳多樣性分析結(jié)果

28份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.47～0.86，平均值為0.59，變幅為0.39，顯示供試的28份獼猴桃樣本遺傳多樣性較為豐富(表4)。其中，美味獼猴桃實(shí)生2號(hào)與實(shí)生3號(hào)、中華獼猴桃華光2號(hào)與美味獼猴桃實(shí)生2號(hào)的遺傳相似系數(shù)均為0.47，顯示它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而美味獼猴桃陳陽與日本國立10號(hào)的遺傳相似系數(shù)為0.86，表明它們之間的親緣關(guān)系較近。

2.3 獼猴桃種質(zhì)聚類分析結(jié)果

如圖2所示，在遺傳相似系數(shù)0.64處可將28份獼猴桃樣本劃分為3個(gè)明顯的聚類分支。聚類群Ⅰ包含18個(gè)美味獼猴桃品種、4個(gè)中華獼猴桃品種以及2個(gè)軟棗獼猴桃[軟棗獼猴桃(雌)和軟棗獼猴桃(雄)]。聚類群Ⅱ包含2個(gè)中華獼猴桃品種華光2號(hào)和華光3號(hào)，以及1個(gè)大籽獼猴桃，顯示這2個(gè)中華獼猴桃品種的遺傳變異較明顯。聚類群Ⅲ包含1個(gè)美味獼猴桃品種實(shí)生2號(hào)，顯示該株系在進(jìn)化上較為獨(dú)立。在遺傳相似系數(shù)0.70處，聚類群Ⅰ可分為Ia、Ib、Ic、Id、Ie 5個(gè)亞分支。其中，Ia分支包含2個(gè)美味獼猴桃；Ib分支包含米坪行上2號(hào)和二郎坪栗坪1號(hào)2個(gè)美味獼猴桃，以及雙龍1號(hào)和武寧魁2個(gè)中華獼猴桃；Ic分支包含13個(gè)美味獼猴桃，如實(shí)生3號(hào)、陳陽、秦香、米良1號(hào)、通渠1號(hào)、貴蜜、長安1號(hào)、徐洲75-2、北京215、金魁、日本國立10號(hào)、艾博特、海沃德2-3，以及1個(gè)中華獼猴桃通山5號(hào)；在Id分支，美味獼猴桃寨根3號(hào)與軟棗獼猴桃(雌)和軟棗獼猴桃(雄)聚類。聚類群Ⅰ的聚類關(guān)系表明，美味獼猴桃與中華獼猴桃以及軟棗獼猴桃具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 基于SCoT標(biāo)記的28份獼猴桃種質(zhì)UPGMA系統(tǒng)聚類結(jié)果Fig.2 UPGMA dendrogram of 28 Actinidia germplasms based on SCoT markers

3 結(jié)論與討論

與其他分子標(biāo)記相比，SCoT標(biāo)記為研究者提供了一種能夠有效跟蹤性狀并獲得與性狀相關(guān)目的基因的新型分子標(biāo)記[15]。本研究對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，并從55條SCoT引物中最終篩選出8條用于獼猴桃種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均每條SCoT引物擴(kuò)增出9.4個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)多態(tài)性比率達(dá)97.3%，顯示了較好的擴(kuò)增效果。28份獼猴桃材料的遺傳相似系數(shù)在0.47～0.86，平均值為0.59，變幅為0.39，表明供試的獼猴桃種質(zhì)間遺傳差異較大，存在較豐富的遺傳多樣性，獼猴桃種內(nèi)遺傳相似性較高，種間遺傳相似性較低。

表4 基于SCoT標(biāo)記的28份獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic similarity coefficient of 28 Actinidia germplasm resources based on SCoT markers

本研究獼猴桃種質(zhì)聚類關(guān)系分析顯示，28份獼猴桃種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)為0.64水平處被劃分為3個(gè)明顯的聚類群，在聚類群Ⅰ中，中華獼猴桃與美味獼猴桃種質(zhì)聚類，表明中華獼猴桃與美味獼猴桃具有較高的遺傳相似性，種質(zhì)親緣關(guān)系較近，遺傳關(guān)系復(fù)雜，推測中華獼猴桃與美味獼猴桃在種群進(jìn)化中發(fā)生了基因漸滲或雜交，該結(jié)論與傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)研究結(jié)論一致，進(jìn)一步論證了美味獼猴桃可能作為中華獼猴桃的硬毛品種[2,16-18]。此外，2個(gè)軟棗獼猴桃與美味獼猴桃和中華獼猴桃聚類在類群Ⅰ中，顯示三者的遺傳關(guān)系復(fù)雜，可能有共同的父系祖先，與基于葉綠體cpDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)論基本一致[19]。在聚類群Ⅱ中，2個(gè)中華獼猴桃品種華光2號(hào)和華光3號(hào)與1個(gè)大籽獼猴桃聚類，顯示部分中華獼猴桃遺傳變異水平較高，種質(zhì)進(jìn)化較為明顯，中華獼猴桃與大籽獼猴桃有較近的遺傳關(guān)系。

本研究基于SCoT分子標(biāo)記的獼猴桃種質(zhì)資源多樣性分析表明，獼猴桃種質(zhì)資源間具有豐富的遺傳多樣性，美味獼猴桃和中華獼猴桃具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，種質(zhì)群體間可能發(fā)生了基因漸滲和雜交，種間存在較近的親本起源和進(jìn)化。SCoT分子標(biāo)記可有效用于獼猴桃種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性研究，為獼猴桃品種改良和新品種選育提供理論支持，為伏牛山野生獼猴桃種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供參考。