房雅麗，張治家，賈晶晶，周瑤瑤，邢 鯤，韓鵬杰

(山西省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，山西 太原 030031)

馬鈴薯黑痣病是危害馬鈴薯生產(chǎn)的土傳病害之一，由RhizoctoniasolaniKühn[有性態(tài)Thanatephoruscucumeris(A.B.Frank) Donk]引起，主要危害幼芽、莖基部和塊莖等，嚴重時造成整個植株死亡[1]。近幾年，由于馬鈴薯規(guī)?；N植的發(fā)展以及重茬連作、遠距離調種和種植方式的改變等造成馬鈴薯黑痣病上升為主要病害[2]。在嚴重發(fā)生年份，黑痣病造成的植株死亡率高達90%以上[3]。目前，馬鈴薯黑痣病的主要防治方法為化學藥劑防治，其中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑 (QoI)嘧菌酯對馬鈴薯黑痣病的防效較好[4-5],然而，病原菌較易對嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性，其屬于高抗藥性風險殺菌劑[6]。因此，開展田間菌株對嘧菌酯的敏感性測定和抗性風險評估，篩選防治馬鈴薯黑痣病的生物源殺菌劑，對促進馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展具有重要意義。

嘧菌酯屬于QoI類殺菌劑，QoI主要通過結合在細胞色素b(Cyt b)的Qo位置抑制線粒體的呼吸，從而抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[7]。有些病原菌在離體條件下可以通過旁路氧化途徑(AOX)躲避嘧菌酯的抑制，因此，通常在測試對嘧菌酯的敏感性時加入水楊肟酸(SHAM)抑制AOX途徑[8]。目前，已報道了4個馬鈴薯黑痣病菌菌株對嘧菌酯的敏感性[3-4,9]，其EC50值差異較大，但目前尚不能確定其差異較大的原因。此外，ARABIAT等[10]研究結果顯示，來自甜菜的立枯絲核菌對嘧菌酯的敏感性變異較大，EC50值為0.43～597.43 μg/mL，平均為49.7 μg/mL。

嘧菌酯作為第一個QoI類殺菌劑，在1996年進入市場，而后陸續(xù)報道了多種植物病原菌對其產(chǎn)生不同程度的抗性。產(chǎn)生抗性的機制與Cytb基因的點突變有關，目前，已報道的主要突變位點有3個，分別位于143位、129位和137位密碼子，其中143位密碼子由甘氨酸突變?yōu)楸彼岬念l率較高，并且導致高抗性的發(fā)生，如Alternariaspp.、Microdochiumnivale、M.majus、Podosphaerafusca和Pseudoperonosporacubensis等病原菌[11-13]；而129位密碼子由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?37位密碼子由甘氨酸突變?yōu)榫彼岬念l率較少，導致的抗性水平較低[14-16]。但是，也有部分植物病原菌表現(xiàn)對QoI敏感性下降卻未在Cytb基因的上述3個位點檢測到突變[6,17-18]。最近報道顯示，在突尼斯馬鈴薯產(chǎn)區(qū)馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗性，但未檢測抗性菌株的Cytb基因序列是否發(fā)生改變[19]。

2007—2016年，我國化學農(nóng)藥商品使用量年均為175.8萬t，全世界排名第一[2]。我國從2015年開始實施《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》，生物源農(nóng)藥替代化學農(nóng)藥配套技術成為化學農(nóng)藥減施主要技術方案之一[20]。然而，目前我國登記的使用對象為馬鈴薯的生物源殺菌劑僅有3種，分別為苦參堿、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和丁子香酚，主要用于晚疫病防治，沒有用于防治馬鈴薯黑痣病的生物源農(nóng)藥[2]。

目前，尚不清楚對嘧菌酯表現(xiàn)低敏感的馬鈴薯黑痣病菌菌株Cytb基因序列是否發(fā)生抗性相關突變及其抗性風險，同時，關于生物源殺菌劑對馬鈴薯黑痣病菌的室內(nèi)毒力測定研究較少。鑒于此，通過菌絲生長速率法測定分離得到的馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性以及SHAM在馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯敏感性測定中的作用，分析高敏感和低敏感菌株的Cytb序列，初步探究其低敏感性的機制，此外，測定了4種生物源殺菌劑對低敏感馬鈴薯黑痣病菌菌株的室內(nèi)毒力，為田間防治馬鈴薯黑痣病提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試15株立枯絲核菌(R.solani)分離自馬鈴薯黑痣病病薯，所有菌株采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市武川縣。

1.1.2 供試藥劑 本試驗共使用7種藥劑進行室內(nèi)毒力測定，分別為0.3%苦參堿水劑(河北省農(nóng)藥化工有限公司)、30%乙蒜素乳油(河南中威高科技化工有限公司)、5%氨基寡糖素水劑(江蘇克勝集團股份有限公司)、1%蛇床子素水劑(內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司)、250 g/L嘧菌酯懸浮劑(先正達作物保護有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(先正達作物保護有限公司)、75%百菌清可濕性粉劑(利民化工股份有限公司)。SHAM購自上海麥克林生化科技有限公司。Bioeasy Taqman master mix購自博日生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯黑痣病菌對供試藥劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定供試藥劑對馬鈴薯黑痣病菌的EC50值。將供試藥劑用無菌水稀釋成系列濃度，加入PDA培養(yǎng)基中配制成一定濃度梯度的含藥平板，以加入等體積無菌水的平板為對照。供試藥劑的終濃度梯度如下：苦參堿的終質量濃度分別為1、2、5、15、30 μg/mL；乙蒜素的終質量濃度分別為1、2、5、10、15 μg/mL；氨基寡糖素的終質量濃度分別為5、25、100、250、500 μg/mL；蛇床子素的終質量濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg/mL；苯醚甲環(huán)唑的終質量濃度分別為2、5、10、20、30 μg/mL；百菌清的終質量濃度分別為0.5、1.5、3、6、10 μg/mL；因菌株的敏感性不同設定了2種嘧菌酯質量濃度梯度，分別為2、4、8、16、32 μg/mL和0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 μg/mL。根據(jù)JIN等[21]的報道，SHAM在嘧菌酯對R.solani的抑制效果中的加和效應不明顯，因此，在最初測試馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性時未在含嘧菌酯的平板中加入SHAM。供試菌株在PDA培養(yǎng)基上生長3 d 后，沿菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅轉接至含藥平板中心，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑。按公式(1)計算不同質量濃度藥劑對菌絲生長的抑制率。在Microsoft Excel中運用NORMINV函數(shù)將抑制率轉換為概率值，而后以概率值為縱坐標(y)，以供試藥劑系列質量濃度的對數(shù)為橫坐標(x)，得到毒力回歸方程y=bx+a及相關系數(shù)(r)，計算EC50值。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%

(1)

1.2.2 SHAM對馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法測定SHAM對馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長的影響。將SHAM用甲醇配制成100 mg/mL母液，而后用甲醇稀釋成系列濃度，加入PDA培養(yǎng)基中配制成一定濃度梯度的含藥平板，使SHAM最終質量濃度分別為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，以加入等體積甲醇(0.1%)的平板為對照。供試菌株在PDA培養(yǎng)基上生長3 d 后，沿菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅接種至含藥平板中心，在25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復3次。按公式(1)計算不同質量濃度SHAM對菌絲生長的抑制率。

1.2.3 SHAM在馬鈴薯黑痣病菌菌株對嘧菌酯敏感性測定中的作用 根據(jù)1.2.2中試驗結果確定的對馬鈴薯黑痣病病原菌菌絲生長影響較小(抑制率<20%)的SHAM質量濃度進行后續(xù)試驗，以確定SHAM在馬鈴薯黑痣病菌株對嘧菌酯敏感性測定中的影響。將嘧菌酯用無菌水稀釋成系列濃度，加入PDA培養(yǎng)基中配制成2、32 μg/mL含藥平板，同時加入用甲醇配制的SHAM，以僅加入SHAM的PDA培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次。按照1.2.1中的方法測定菌落直徑，并按公式(1)計算SHAM存在條件下嘧菌酯對菌絲生長的抑制率。

1.2.4 馬鈴薯黑痣病菌DNA的提取 馬鈴薯黑痣病菌DNA的提取方法參考CENIS[22]的方法：在1.5 mL離心管中加入0.5 mL PDB培養(yǎng)基，接種少量馬鈴薯黑痣病菌菌絲，在25 ℃下培養(yǎng)3 d后，10 000 r/min離心5 min，去上清，用0.5 mL 1×TE進行洗滌，之后加入0.3 mL快速提取緩沖液，在Qiagen TissueLyserⅡ上進行破碎后加入0.15 mL 3 mol/L NaAc，-20 ℃靜置10 min后，12 000 r/min離心10 min，將上清轉入另一離心管中，加入等體積異丙醇室溫沉淀10 min后，12 000 r/min離心10 min，75%乙醇洗滌后干燥，加入0.04 mL 1×TE溶解備用。

1.2.5 馬鈴薯黑痣病菌Cytb基因部分序列分析 選取對嘧菌酯敏感性存在差異的8株馬鈴薯黑痣病菌，用于探尋病原菌對嘧菌酯抗性的分子機制。利用Vector NTI設計引物RsCytb143-F/RsCytb143-R和RsCytb129-F/RsCytb129-R(表1),擴增與嘧菌酯抗性相關的區(qū)域。將擴增得到的Cytb部分序列與立枯絲核菌線粒體基因組(Rhizoctoniasolanistrain AG3 Rhs1AP,NC_021436.1)進行比對。PCR反應總體系為30 μL，包含1 ×Bioeasy Taqman master mix，200 nmol/L正向引物和反向引物，以及基因組DNA模板。PCR 反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化回收后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序。通過DNAstar軟件采用Cluster W方法進行序列比對分析。

表1 立枯絲核菌Cyt b基因分子特征分析所用引物Tab.1 Primers used in molecular characterization of cytochrome b(Cyt b) gene from R.solani

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性

由表2可見，在測試的15株馬鈴薯黑痣病菌中，H15對嘧菌酯較為敏感，嘧菌酯質量濃度為2、32 μg/mL時，對H15的抑制率分別為64.76%、75.62%，而對其他14株低敏感菌株的抑制率分別為3.62%～25.78%、9.50%～50.96%。當嘧菌酯質量濃度升高時，對H14菌株的抑制率增加不明顯，而對其他14株菌株的抑制率顯著增加。嘧菌酯對H15的EC50值為0.49 μg/mL，對H9的EC50值接近32 μg/mL，而對其余13株菌的EC50值均>32 μg/mL。結果表明，在武川縣分離的15株馬鈴薯黑痣病菌中，14株菌對嘧菌酯的敏感性較低。

表2 馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性Tab.2 Sensitivity of R.solani to azoxystrobin

注：同行不同小寫字母表示在5%水平差異顯著。
Note:Different lowercase letters in the same row indicate significant differences at 5% level.

2.2 水楊肟酸對馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長的影響

SHAM對馬鈴薯黑痣病菌具有一定的抑制作用，隨著質量濃度的升高，抑制作用增加。當SHAM質量濃度為10、20、40 μg/mL時，抑制率分別為3.85%～4.92%、3.85%～17.29%和9.62%～18.18%。當SHAM質量濃度大于40 μg/mL時，對H9的抑制率≥32.33%(表3)。根據(jù)已有研究報道，SHAM的最佳質量濃度應對菌絲生長具有一定抑制作用，但抑制率小于20%[23]，因此，后續(xù)選擇SHAM質量濃度為40 μg/mL進一步測定馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性。

表3 不同質量濃度水楊肟酸對馬鈴薯黑痣病菌的抑制率Tab.3 The inhibitory rate of SHAM to R.solani at different concentration

注：-表示未進行測試。Note:- means untested.

2.3 水楊肟酸在馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯敏感性測定中的作用

為了確定對嘧菌酯低敏感的馬鈴薯黑痣病菌菌株是否是因為存在旁路呼吸途徑躲避QoI的抑制作用，加入SHAM阻斷旁路氧化途徑后，測試部分馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性。

由表4可知，添加SHAM后，嘧菌酯對馬鈴薯黑痣病菌的抑制率有一定程度的升高，高敏感菌株H15的EC50值由0.49 μg/mL降低為0.037 μg/mL，低敏感菌株中只有H9菌株的EC50值下降，其余菌株在嘧菌酯質量濃度為2、32 μg/mL時，抑制率顯著增加，但EC50值仍然>32 μg/mL?？梢姡琒HAM可以提高馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性，但對于不同菌株其效果有一定差別。

表4 添加及不添加水楊肟酸條件下馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性Tab.4 Sensitivity of R.solani to azoxystrobin with or without SHAM

注：同行不同小寫字母表示分別在添加、不添加SHAM條件下相同質量濃度密菌酯的抑制率差異顯著(P<0.05)。
Note:Different lowercase letters in the same row indicate significant differences of inhibition rate at the same concentration of axoxystrobin between with and without SHAM.

2.4 馬鈴薯黑痣病菌Cyt b序列特征分析

將測序結果與立枯絲核菌線粒體基因組(NC_021436.1)的Cytb序列進行比對分析，根據(jù)其注釋結果，在與嘧菌酯抗性相關的G143位密碼子后無內(nèi)含子插入(圖1A)。擴增高敏感的H15菌株和低敏感的7株馬鈴薯黑痣病菌基因組中的序列，其中包含3個抗性位點(F129、G137、G143)及部分內(nèi)含子。比對結果顯示，所有菌株Cytb基因的G143位密碼子后無內(nèi)含子插入，并且在上述3個位點上堿基序列一致，未出現(xiàn)與抗性相關的點突變(圖1B)。

A.細胞色素b部分序列結構，方框表示外顯子，線型表示內(nèi)含子，虛線方框表示包含與QoI抗性相關的3個密碼子；B.對嘧菌酯敏感性存在差異的8株馬鈴薯黑痣病菌株Cyt b基因部分序列比對結果，虛線方框表示129位、127位和143位密碼子A.Sequence structure in the partial Cyt b fragment.Boxes indicate exons;Line indicates intron;Dotted line boxes illustrates three codons conferring QoIs resistance.B.Alignment of the partial nucleotide sequences of the Cyt b gene from 8 R.solani isolates.Dotted line boxes indicate codon 129,137 and 143圖1 馬鈴薯黑痣病菌細胞色素b(Cyt b)基因的部分序列分析Fig.1 Characterization of parital cytochrome b gene(Cyt b) sequence obtained from R.solani

2.5 馬鈴薯黑痣病菌對生物源殺菌劑的敏感性

以百菌清和苯醚甲環(huán)唑為對照藥劑，選擇對嘧菌酯表現(xiàn)低敏感菌株H2測試其對4種生物源殺菌劑的敏感性，百菌清、苯醚甲環(huán)唑對H2菌株的EC50值分別為3.50、9.24 μg/mL，苦參堿、乙蒜素、氨基寡糖素、蛇床子素對H2菌株的EC50值分別為15.81、7.72、116.58、4.57 μg/mL(表5)。生物源藥劑中，蛇床子素和乙蒜素的效果最好，其次為苦參堿，氨基寡糖素的抑菌率最低。蛇床子素和乙蒜素的抑菌效果與化學藥劑百菌清和苯醚甲環(huán)唑相似，可以作為防治馬鈴薯黑痣病的備選藥劑。

表5 幾種生物源殺菌劑對馬鈴薯黑痣病菌的抑制水平Tab.5 Inhibition of several biological fungicides to R.solani

3 結論與討論

嘧菌酯自1996年問世以來，用于多種植物病害的防治。目前，已經(jīng)報道了4個馬鈴薯黑痣病菌株對嘧菌酯的敏感性，EC50值分別為4.45×10-9μg/mL[9]、8.32 μg/mL[3]、0.08 μg/mL和0.05 μg/mL[4]。其中，張智芳等[9]和劉寶玉等[3]采用菌絲生長速率法測定菌株對嘧菌酯的敏感性，與本研究采用的方法相同，與本試驗中EC50值0.49 μg/mL和≥32 μg/mL相比，嘧菌酯對馬鈴薯黑痣病菌菌株的EC50值變異更大。由于在離體條件下，病原菌可以通過旁路氧化途徑躲避嘧菌酯的抑制，故在菌株敏感性測試中加入SHAM，試驗結果表明，加入SHAM后馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性增加，但對于低敏感菌株H5和H16敏感性的增加幅度不大，EC50值仍>32 μg/mL。來自甜菜的R.solani對嘧菌酯的敏感基線已經(jīng)建立，EC50值為0.43～597.43 μg/mL，平均為49.70 μg/mL，活體試驗顯示，推薦劑量的嘧菌酯可以有效控制高EC50值菌株的侵染，推測較高的EC50值可能是由于存在旁路氧化途徑的其他機制所造成的，該機制不同于目前已報道的可被SHAM抑制的旁路呼吸途徑[10]。本試驗中，嘧菌酯對馬鈴薯黑痣病菌的EC50值也存在變異較大的現(xiàn)象。嘧菌酯對在突尼斯分離到的4株馬鈴薯黑痣病菌的EC50值大于30 μg/mL，推測其可能是抗性菌株[19]。然而，本試驗檢測了7株低敏感和1株高敏感菌株的Cytb序列，在已報道的3個Cytb主要突變位點上未檢測到點突變。雖然植物病原菌對嘧菌酯的抗性可能存在其他機制，例如，M.fructicola對嘧菌酯表現(xiàn)為敏感性下降，然而其Cytb基因上未檢測到與嘧菌酯抗性相關的點突變[17,24]，但是根據(jù)來自甜菜的R.solani對嘧菌酯的敏感性研究結果，對嘧菌酯表現(xiàn)低敏感的馬鈴薯黑痣病菌株可能需要進一步活體試驗確定是否為抗性菌株，有可能是由于存在旁路氧化途徑的其他機制使得離體條件下馬鈴薯黑痣病菌對嘧菌酯的敏感性較低。

對嘧菌酯表現(xiàn)高抗的菌株一般是發(fā)生了Cytb基因143位密碼子的點突變，F(xiàn)129和G137位點的突變產(chǎn)生低或者中等抗性，目前報道高抗病原菌的Cytb基因G143位密碼子后沒有插入內(nèi)含子，在Cytb基因G143密碼子后有內(nèi)含子插入的病原菌不容易產(chǎn)生高抗菌株[24-25]。G143位密碼子后插入的內(nèi)含子為Ⅰ型內(nèi)含子，可以進行自我剪切，而G143位密碼子位于該內(nèi)含子的內(nèi)在前導序列(Internal guide sequence，IGS)中，該位點的突變會影響Cytb基因mRNA的正確剪接，使得突變菌株死亡，因此這類病原菌不易產(chǎn)生對嘧菌酯的抗性[26]，而本試驗中，R.solani中G143位密碼子后沒有內(nèi)含子，暗示馬鈴薯黑痣病菌較容易產(chǎn)生對嘧菌酯的抗性。因此，本研究測試了4種生物源殺菌劑對馬鈴薯黑痣病菌的抑制效果，以作為防治馬鈴薯黑痣病的備選藥劑。其中，蛇床子素和乙蒜素的效果較好，與百菌清和苯醚甲環(huán)唑的效果相似，其次為苦參堿。氨基寡糖素的抑菌效果較差，但其具有激發(fā)植物免疫反應的作用，之后可通過活體試驗確定其防治效果。這4種生物源殺菌劑中蛇床子素和乙蒜素可作為防治馬鈴薯黑痣病菌的候選藥劑。