程忠強(qiáng) 蔣成義 韓躍峰 王斌

有關(guān)研究資料顯示［1］,miR-34a在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào),并與患者不良臨床病理特征相關(guān)；生物信息學(xué)分析顯示,受體絡(luò)氨酸激酶家族成員AXL的mRNA3’-UTR具有miR-34a特異性結(jié)合的序列,是miR-34a的下游靶點(diǎn)之一。研究證實(shí)［2］,AXL mRNA和蛋白的表達(dá)水平在鼻咽癌組織中均顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織。鼻咽癌組織中AXL高表達(dá)與出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較高的TNM分期及患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。因此,推測(cè)miR-34a可能在鼻咽癌細(xì)胞中通過(guò)抑制AXL/PI3K/Akt/Snail信號(hào)通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,最終發(fā)揮抗腫瘤侵襲作用。本研究進(jìn)一步分析miR-34a在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)患者預(yù)后的影響,利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),在鼻咽癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)miR-34a,研究其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,闡明miR-34a在鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,探討其應(yīng)用于鼻咽癌基因治療的潛在價(jià)值,為鼻咽癌治療提供新思路?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院耳鼻喉頭頸外科2018年1月～2019年1月收治的60例鼻咽癌患者,根據(jù)miR-34a在鼻咽癌組織中的表達(dá)狀態(tài)分為miR-34a高表達(dá)組(鼻咽癌組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)量/對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)量≥1)、miR-34a低表達(dá)組(miR-34a相對(duì)表達(dá)量/對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a相對(duì)表達(dá)量＜1),各30例。miR-34a低表達(dá)組男18例,女12例；平均年齡(67.3±4.9)歲。miR-34a高表達(dá)組男20例,女10例；平均年齡(66.8±5.0)歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均在知情下參與；均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)；未接受過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：中途退出本次研究者；依從性差者。

1.2方法 患者均行手術(shù)切除或病理活檢的鼻咽癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織。

1.2.1培養(yǎng)方法 在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每隔48～72 h使用酶消化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代,后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用傳代2～3代細(xì)胞。

1.2.2定時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)miR-34a在不同細(xì)胞株中的表達(dá)情況 收集細(xì)胞后加入Trizol (1 ml)、異丙醇,離心后,收集RNA沉淀物；檢測(cè)RNA的純度以及完整性,檢測(cè)miR-34a；按照試劑說(shuō)明書(shū)配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,合成cDNA。

1.2.3細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h后的CNE-2細(xì)胞,以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸并接種于6孔板上,接種密度以過(guò)夜可鋪滿平板為準(zhǔn)。每孔細(xì)胞均采用200 μl無(wú)菌移液器吸頭縱向劃線。以PBS洗去懸浮細(xì)胞,采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基在含5% CO2的37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞遷移情況。

1.2.4細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 基質(zhì)膠使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至1 mg/ml后包被transwell小室底部膜的上室面。取轉(zhuǎn)染48 h后的CNE-2細(xì)胞,以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105/ml。在transwell小室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液,將transwell小室置于24孔板中,并在24孔板內(nèi)添加750 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞在含5% CO2的37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后置于4% 多聚甲醛溶液中固定2 min,然后于甲醇中浸潤(rùn)20 min。棉棒輕柔擦去transwell小室底部膜的上室面細(xì)胞,將下室面置于0.3%結(jié)晶紫溶液中染色15 min,PBS洗去多余染料。在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.3觀察指標(biāo) 比較鼻咽癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a的相對(duì)表達(dá)量；不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量；miR-34a高表達(dá)組和miR-34a低表達(dá)組患者5年總生存率和5年無(wú)病生存率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線法分析生存率。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鼻咽癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a的相對(duì)表達(dá)量比較 鼻咽癌組織miR-34a的相對(duì)表達(dá)量(2.654±0.198)低于對(duì)應(yīng)癌旁組織的(5.401±0.447),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 鼻咽癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1 鼻咽癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-34a的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注：與對(duì)應(yīng)癌旁組織比較,aP＜0.05

2.2不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較 不同年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表2 不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注：不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)比較,P＜0.05

2.3miR-34a高表達(dá)組和miR-34a低表達(dá)組患者5年總生存率和5年無(wú)病生存率比較 miR-34a高表達(dá)組患者5年總生存期率和5年無(wú)病生存率分別為60.0%(18/30)、33.3%(10/30),與miR-34a低表達(dá)組的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA,通過(guò)與靶基因3’未翻譯區(qū)域結(jié)合介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控功能［3］。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化以及腫瘤形成等生理病理過(guò)程中起著重大作用,現(xiàn)階段來(lái)看,在多種腫瘤中已經(jīng)檢測(cè)到miRNA的表達(dá),并且與腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤的轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)［4］。因此,研究miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的具體作用機(jī)制且改變細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平等具有重要意義。

miRNA參與到鼻咽癌患者的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程,通過(guò)不同靶點(diǎn)發(fā)揮出抑癌基因作用。有關(guān)研究資料顯示［5］,miR-34a低表達(dá)或者失表達(dá)是腫瘤演化中的常見(jiàn)情況,miR-34a主要扮演抑癌基因。有關(guān)研究顯示［6］,miR-34a在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào),并與患者不良臨床病理特征相關(guān),但在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本文研究結(jié)果顯示,鼻咽癌組織miR-34a的相對(duì)表達(dá)量(2.654±0.198)低于對(duì)應(yīng)癌旁組織的(5.401±0.447),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示鼻咽癌組織miR-34a相對(duì)表達(dá)量低于正常水平。miR-34a誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)放化療的敏感度。除此之外,miR-34a還參與到腫瘤干細(xì)胞分化過(guò)程之中,促使腫瘤干細(xì)胞分化,有關(guān)研究顯示［7］,miR-34a可顯著阻止腫瘤的生長(zhǎng)。由于不同腫瘤具有不同的遺傳學(xué)背景,因此miR-34a的抑制腫瘤增殖機(jī)制也表現(xiàn)不同。體外實(shí)驗(yàn)研究資料顯示［8］,miR-34a過(guò)度表達(dá)可顯著抑制鼻咽癌患者的克隆形成能力以及增殖能力,與此同時(shí)促進(jìn)腫瘤凋亡。

本文研究結(jié)果顯示,不同年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)患者鼻咽癌組織的miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。miR-34a高表達(dá)組患者5年總生存期率和5年無(wú)病生存率分別為60.0%(18/30)、33.3%(10/30),與miR-34a低表達(dá)組的60.0%(18/30)、36.7%(11/30)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示miR-34a的相對(duì)表達(dá)與不良臨床病理特征密切相關(guān)。有關(guān)資料顯示,miR-34a與EB病毒感染關(guān)系較為密切,EB病毒感染狀態(tài)與miR-34a密切相關(guān)。由于鼻咽癌與EB病毒感染密切相關(guān),因此在有關(guān)研究中需謹(jǐn)慎選擇實(shí)驗(yàn)對(duì)象［9,10］。

綜上所述,miR-34a在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正常細(xì)胞,并且與患者的不良臨床病理特征密切相關(guān),上調(diào)miR-34a表達(dá)能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲。