李 鎮(zhèn) ，陳 亮 ，林敬明 ，卓 越 ，江朝娜

（1.海南省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 三亞 572000； 2.海南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199）

過(guò)敏性哮喘是以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性（AHR）和可逆性氣道阻塞為特征的氣道慢性炎癥性疾病，其病理特征包括炎癥細(xì)胞充盈、水腫，肥大細(xì)胞活化、氣道上皮細(xì)胞剝落和膠原沉積[1]。過(guò)敏性哮喘與CD4+T淋巴細(xì)胞亞群-輔助性T細(xì)胞1（Th1）／Th2及其特有的細(xì)胞因子的失衡密切相關(guān)[2]。Ⅰ型過(guò)敏是由對(duì)過(guò)敏原的特異性免疫反應(yīng)引起的，主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)[3]。Th2細(xì)胞合成高水平的白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-5和 IL-13，導(dǎo)致過(guò)敏原特異性免疫球蛋白E（IgE）的釋放和肥大細(xì)胞介質(zhì)的產(chǎn)生[4]。此外，誘導(dǎo)組胺和白三烯釋放的Th2細(xì)胞因子與 AHR 相關(guān)[5]。與 Th2細(xì)胞相比，干擾素 γ（IFN-γ）、IL-12等Th1細(xì)胞因子參與拮抗Th2細(xì)胞反應(yīng)和IgE合成，抑制過(guò)敏性哮喘的進(jìn)展[6]。近年來(lái)，抑制Th2細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)Th1／Th2平衡來(lái)預(yù)防和治療哮喘受到關(guān)注[7]。七葉亭是天然藥物秦皮的有效活性成分，具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[8]。本研究中探討了七葉亭對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠的治療作用及對(duì)Th1／Th2細(xì)胞因子的影響，為其用于防治過(guò)敏性哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：GYD-003型大小鼠肺功能檢測(cè)儀（法國(guó)Emka公司）；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備（德國(guó)Leica公司）；Sunrise型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

試藥：七葉亭（浙江省湖州市之江有限公司，純度大于98%，批號(hào)為Z5250）；地塞米松磷酸鈉注射液（河南科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)為 13011911）；卵白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)分別為118K7002，MKBC0623）；醋甲膽堿（美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)為118K7028）；蘇木素染色液（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)為 C0107）；IFN-γ，IL-4和IgE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司 ，批 號(hào) 分 別 為 mL063160，mL076941，mL059784）；CD3-APC，CD4-FITC，IFN-γ 抗體和 IL-4抗體（美國(guó) BD公司，批號(hào)分別為 BD003-1-2，BD001-3-2，BD005-1-2，BD004-1-1）。

動(dòng)物：C57BL／6小鼠購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（冀）2012-0002。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備與給藥

選 60只體質(zhì)量 25～30 g的雄性 C57BL／6小鼠，在SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠均分為對(duì)照組(A組)，模型組(B組)，地塞米松組(C組)和七葉亭低、中、高劑量組(D1，D2，D3組)，各10只。采用OVA聯(lián)合氫氧化鋁凝膠多次激發(fā)致敏法造模[9]。致敏階段：在實(shí)驗(yàn)第1，8，15天對(duì)B組、C 組和 D1，D2，D3組小鼠腹腔注射 2%OVA 1 mL 和氫氧化鋁凝膠（200 ng／mL）1 mL；激發(fā)階段：在實(shí)驗(yàn)第25～29天用霧化器泵入 1%OVA 溶液（0.2 mL），每日1次，持續(xù)5 d。A組用生理鹽水替代OVA和氫氧化鋁凝膠，其他操作相同。藥物干預(yù)：在第16～29天（連續(xù)14 d）D1，D2，D3組小鼠腹腔注射七葉亭（100，200，400 mg／kg），C 組小鼠腹腔注射地塞米松（1.25 mg／kg），作為陽(yáng)性對(duì)照，A組和B組小鼠腹腔注射生理鹽水。末次給藥24 h后，處死小鼠。

1.3 觀察指標(biāo)

氣道反應(yīng)性測(cè)定：末次給藥24 h后，麻醉小鼠并固定，暴露氣管，在氣管上剪1個(gè)小口，插入插管并固定，連接小鼠肺功能儀。給予不同濃度的醋甲膽堿，記錄各組小鼠氣道阻力值。

病理學(xué)檢查：氣道反應(yīng)性測(cè)定結(jié)束后，分離肺組織，右肺上葉用甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、切片（3 μm），用蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理改變。

ELISA法檢測(cè) IFN-γ，IL-4和 IgE含量：結(jié)扎左側(cè)主支氣管近端和氣管遠(yuǎn)端，在氣管結(jié)扎下端用0.3 mL預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行左肺灌洗，重復(fù)3次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ，IL-4，IgE的含量。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞：無(wú)菌取出脾臟，置含RPMI-1640培養(yǎng)基的EPP管中，制備單細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔200 μL，與乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA，50 ng ／mL）和離子霉素（1 g／L）在 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h。然后用抗小鼠CD3和CD4抗體，在4℃下標(biāo)記細(xì)胞30 min。將細(xì)胞固定在Perm／Wash緩沖液中，在黑暗中透化 20 min，加入 IFN-γ和IL-4抗體，4℃孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色的細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表3和圖1至圖3。小鼠肺組織病理學(xué)檢查顯示，A組肺組織炎性細(xì)胞較少；B組肺組織中炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)支氣管周和血管周結(jié)締組織，主要為白細(xì)胞浸潤(rùn)，且大多數(shù)白細(xì)胞是嗜酸性粒細(xì)胞；給予地塞米松和七葉亭后，與B組相比，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減弱；C組和D3組作用相似(見圖1)。

3 討論

過(guò)敏性哮喘是兒童和成人最常見的慢性呼吸道疾病，迄今已有多種治療過(guò)敏性哮喘的藥物如地塞米松、白三烯抑制劑、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑和β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，但僅能對(duì)癥治療，長(zhǎng)期服用可能產(chǎn)生較嚴(yán)重的不良反應(yīng)[10]。亞洲許多國(guó)家常用中草藥來(lái)治療過(guò)敏性哮喘，但尚不清楚其治療功效和作用方式[11]。本研究中，七葉亭作用于過(guò)敏性哮喘小鼠模型有效。

表1 不同醋甲膽堿質(zhì)量濃度下各組小鼠氣道阻力值變化比較[±s，cmH2O ／(s·mL)]

表1 不同醋甲膽堿質(zhì)量濃度下各組小鼠氣道阻力值變化比較[±s，cmH2O ／(s·mL)]

注：與 A 組比較，aP ＜0.05；與 B 組比較，bP ＜0.05；與 C 組比較，cP ＜0.05；與 D1組比較，dP ＜0.05；與 D2組比較，eP ＜0.05。下表同。

醋甲膽堿(m g／m L)組別0 A組B組C組D 1組D 2組D 3組1.8 2 ± 0.3 1 1.9 8 ± 0.4 2 1.7 5 ± 0.4 8 1.9 0 ± 0.6 3 1.7 9 ± 0.5 2 1.9 8 ± 0.2 7 3.1 2 5 2.5 0 ± 0.6 4 2.7 7 ± 0.9 9 2.9 6 ± 1.3 4 2.9 6 ± 0.4 8 2.8 3 ± 0.6 0 2.7 9 ± 0.9 2 6.2 5 5.7 3 ± 0.4 2 6.7 1 ± 1.1 0 6.1 6 ± 0.6 8 6.6 2 ± 0.7 4 6.3 7 ± 1.8 9 6.2 5 ± 1.2 5 1 2.5 8.3 6 ± 0.3 7 1 4.5 1 ± 1.0 2 a 1 0.4 2 ± 1.7 4 ab 1 3.8 9 ± 2.8 9 ac 1 2.6 3 ± 0.3 7 abcd 1 0.3 3 ± 1.8 5 abde 2 5 1 1.8 4 ± 1.4 0 1 6.9 2 ± 2.7 2 a 1 3.2 2 ± 1.6 3 ab 1 5.2 7 ± 0.4 7 abc 1 4.4 2 ± 0.8 4 abcd 1 3.2 8 ± 0.2 5 abde

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比較（±s，pg ／mL）

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比較（±s，pg ／mL）

組別A組B組C組D1組D2組D3組IFN-68.38 ± 4.59 24.47 ± 5.28a 52.63 ± 6.14ab 30.73 ± 3.91abc 41.82 ± 4.34abcd 51.78 ± 5.69abde IL-4 58.50 ± 6.64 94.57 ± 7.36a 62.26 ± 3.90ab 88.85 ± 4.07abc 75.87 ± 3.94abcd 63.84 ± 5.15abde IgE 0.07 ± 0.02 0.32 ± 0.06a 0.13 ± 0.03ab 0.25 ± 0.05abc 0.19 ± 0.04abcd 0.14 ± 0.02abde

表3 各組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞百分率比較（±s）

表3 各組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞百分率比較（±s）

組別A組B組C組D 1組D 2組D 3組C D 4+I F N- +（% ）2.4 2 ± 0.1 6 0.9 8 ± 0.1 0 a 1.7 4 ± 0.1 4 ab 1.1 2 ± 0.0 8 abc 1.4 6 ± 0.1 1 abcd 1.7 6 ± 0.5 1 abde C D 4+I L-4+（% ）2.2 1 ± 0.2 1 5.4 6 ± 0.3 2 a 2.7 1 ± 0.4 0 ab 4.2 5 ± 0.5 3 abc 3.9 4 ± 0.4 6 abcd 2.7 8 ± 0.6 8 abde T h 1／T h 2 1.1 5 ± 0.1 8 0.1 8 ± 0.0.0 4 a 0.6 5 ± 0.0 8 ab 0.2 4 ±0 0 4 abc 0.3 7 ± 0.0 4 abcd 0.6 2 ± 0.1 7 abde

氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和AHR是過(guò)敏性哮喘的特征，AHR是通常在哮喘患者中觀察到的支氣管收縮的量度，由于氣道平滑肌（ASM）收縮或肥大引起的支氣管收縮和氣道炎癥可導(dǎo)致肺功能下降[12]。在給予醋甲膽堿質(zhì)量濃度為 12.5 mg／mL和 25 mg／mL時(shí)，B組小鼠氣道阻力高于A組，用地塞米松和不同劑量的七葉亭干預(yù)可降低氣道阻力，且C組和D3組降低氣道阻力的效果相當(dāng)。結(jié)果表明，吸入醋甲膽堿后七葉亭可抑制OVA誘導(dǎo)的AHR。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化

炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子參與過(guò)敏性哮喘的發(fā)生，特別是嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向肺的遷移是過(guò)敏性氣道炎癥發(fā)生的主要原因[13]。組織病理學(xué)研究結(jié)果顯示，七葉亭治療顯著減少了肺組織中白細(xì)胞浸潤(rùn)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。嗜酸性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的依賴過(guò)敏原的Th2免疫應(yīng)答，并減弱Th1應(yīng)答[14]。在生理?xiàng)l件下，Th0細(xì)胞按比例分化為Th1和Th2細(xì)胞，且數(shù)量保持相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡一旦被打破，疾病就會(huì)發(fā)生。據(jù)報(bào)道，過(guò)敏性哮喘患者存在Th1／Th2細(xì)胞失衡[15]。Th1／Th2比值的變化被證實(shí)是哮喘增加氣道炎癥的一個(gè)初始因素，如能逆轉(zhuǎn)Th1／Th2細(xì)胞的不平衡狀態(tài)，就有可能成為哮喘治療的潛在有益藥物。Th2細(xì)胞合成高水平的IL-4，IL-5，IL-13，導(dǎo)致IgE的產(chǎn)生和肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)，誘導(dǎo)氣道炎性反應(yīng)，如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜酸性粒細(xì)胞活化、黏液高分泌[16]。IFN-γ和IL-12參與拮抗Th2細(xì)胞反應(yīng)和IgE合成，抑制哮喘的進(jìn)展[17]。IgE是影響制訂抗哮喘策略的關(guān)鍵靶點(diǎn)，是引起過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)展的重要因素之一。既往研究表明，抗IgE治療可能對(duì)過(guò)敏性疾病有效[18]，故推測(cè)IgE的產(chǎn)生和Th1／Th2細(xì)胞因子平衡是評(píng)價(jià)抗過(guò)敏性哮喘作用的重要指標(biāo)。Rb1顯著抑制細(xì)胞因子IL-4和IgE水平，增加IFN-γ水平，恢復(fù)Th1／Th2比值接近正常水平，提示七葉亭可恢復(fù)哮喘患者Th1／Th2細(xì)胞的平衡。

圖2 各組小鼠脾臟中CD4+IFN- +細(xì)胞百分率比較

圖3 各組小鼠脾臟中CD4+IL-4+細(xì)胞百分率比較

氣道炎癥是由復(fù)雜的相互連接的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，與哮喘相關(guān)的氣道炎癥的確切分子機(jī)制仍有待闡明。已經(jīng)證實(shí)信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4（STAT4）和STAT6的活化在Th0細(xì)胞沿Th1和Th2通路的分化中起關(guān)鍵作用[19]。STAT6信號(hào)通路主要由IL-4誘導(dǎo)，IL-4誘導(dǎo)STAT6轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，快速誘導(dǎo) GATA-3的表達(dá)。GATA-3的表達(dá)是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子c-MAF，是一種有效的IL-4基因特異性激活劑。這形成了IL-4誘導(dǎo)GATA轉(zhuǎn)錄因子3（GATA3）和Th2分化的正反饋回路[20]。而STAT4信號(hào)通路主要由IL-12誘導(dǎo)，STAT4的激活誘導(dǎo) T-bet表達(dá)，T-bet通過(guò)染色質(zhì)重構(gòu)激活I(lǐng)FN-γ基因，分泌IFN-γ，增加IL12Rb2鏈的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)IL-12信號(hào)[21]。STAT4／6信號(hào)通路的失調(diào)參與變應(yīng)性哮喘的發(fā)生，在變應(yīng)性哮喘進(jìn)展的控制中有重要作用，具有作為治療干預(yù)靶點(diǎn)的潛力。但本研究中未對(duì)七葉亭治療過(guò)敏性哮喘具體分子機(jī)制進(jìn)行研究，將在后續(xù)研究中完善。

綜上所述，七葉亭能減輕過(guò)敏性哮喘小鼠氣道阻力和氣道炎癥，通過(guò)抑制IL-4、改善IFN-γ來(lái)調(diào)控Th1／Th2失衡，進(jìn)而改善過(guò)敏性哮喘的進(jìn)展，可作為過(guò)敏性哮喘患者的潛在免疫治療藥物，但仍需進(jìn)一步研究七葉亭治療過(guò)敏性哮喘的分子機(jī)制。