徐岳正，王晶晶，蔣予箭，李智慧，2，周建弟，2

（1.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000；2.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000；3.浙江工商大學食品與生物技術(shù)學院，浙江杭州 310012）

固定化技術(shù)是用物理或化學方法將游離的酶或細胞限定在一定的空間區(qū)域，既能保持本身活性，又能連續(xù)反應之后回收和反復利用[1]。傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵用游離細胞發(fā)酵，酵母隨發(fā)酵液不斷流失，使發(fā)酵罐中酵母濃度不夠，造成酒精發(fā)酵速度慢，時間長，使用發(fā)酵罐多；采用固定化酵母發(fā)酵，細胞濃度大，發(fā)酵速度快[2]。有外國學者[3]研究發(fā)現(xiàn)，如果選擇合適的載體固定酵母進行發(fā)酵，與游離酵母相比，酯醇比會更高，有利于形成果香和提高風味。

固定化技術(shù)已運用于酒精、白酒、葡萄酒、啤酒及果酒的生產(chǎn)，如固定化技術(shù)應用于啤酒中能明顯縮短主發(fā)酵、后發(fā)酵時間[4]，也可用于生產(chǎn)低醇或無醇啤酒[5-6]。酵母菌對黃酒發(fā)酵有重要作用，它的發(fā)酵副產(chǎn)物是黃酒中香氣物質(zhì)的重要來源[7]。在固定化條件下，酵母菌改變了自身存在方式，酵母菌的生存、增殖、發(fā)酵不僅受到發(fā)酵液的環(huán)境、營養(yǎng)物質(zhì)等的影響，還受到固定化體系、載體傳質(zhì)阻力、載體中其他酵母的影響。

本文研究在固定化條件下酵母包埋量對黃酒發(fā)酵過程中理化指標和香氣物質(zhì)生成量的影響，尋找合適的酵母包埋量，為固定化酵母替代傳統(tǒng)游離酵母發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

糯米，購于超市；液化酶、糖化酶、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；釀酒酵母，安琪黃酒專用活性干酵母，市售。

耗材及試劑：葡萄糖、海藻酸鈉、氯化鈣、消泡劑、硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、甲基紅、無水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。正丙醇，異丁醇，異戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯，均為分析標準品，≥99.9%(GC)，乙酸(＞99%)，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器設備：HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；TG16-WS 型臺式高速離心機，滄州路儀實驗儀器有限公司；25×16 型血球計數(shù)板，泰州市育才教學設備有限公司；血球計數(shù)板，泰州市育才教學設備有限公司；44X3 型生物顯微鏡，上海光學儀器一廠；PHS-3C 型酸度計，上海雷磁儀器廠；ZNCL-BS 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海越眾設備儀器有限公司；GC-2014C 型氣相色譜儀，日本島津有限公司；AOC-20i 型自動進樣器，日本島津有限公司；FFAP（30 m×0.20 mm×0.25 μ m）型毛細管色譜柱，上海安因科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌液的制備

用天平稱取30 g黃酒活性干酵母加入到450 mL已滅過菌的2%葡萄糖溶液中，38 ℃保溫活化30 min，再3000 r/min離心10 min，棄去上清液，得到底部的酵母泥。取酵母泥40 g 加入到180 mL 滅菌的蒸餾水中，得到活化好的酵母菌液。

1.2.2 固定化酵母顆粒的制備

將制備的酵母菌液與9 倍1.5%的海藻酸鈉溶液混勻，在37 ℃水浴條件下用10 mL注射器滴加到4%CaCl2溶液中。在21 ℃水浴條件下固定化1 h，最后用無菌水沖洗數(shù)遍放入0.05% CaCl2溶液，4 ℃平衡過夜，備用。

1.2.3 發(fā)酵液制備

糯米用粉碎機粉碎，過60目篩備用。在1000 mL錐形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸餾水，攪拌均勻后加入1 g液化酶，70 ℃水浴鍋中液化60 min，冷卻至50 ℃后加麥曲37.5 g保溫糖化4 h，3000 r/min離心10 min，上清液于121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.4 黃酒固定化發(fā)酵方法

取5 個1000 mL 的錐形瓶，每個瓶中分別加入800 mL 發(fā)酵液以及一定數(shù)量的固定化酵母顆粒，使發(fā)酵液酵母濃度分別為0.2×107個/mL、0.6×107個/mL、1.0×107個/mL、1.4×107個/mL、1.8×107個/mL 5 個水平，置于28 ℃培養(yǎng)箱主發(fā)酵5 d，而后在15 ℃下發(fā)酵15 d。

主發(fā)酵每天取樣，后發(fā)酵第7 d、9 d、11 d、14 d、17 d、20 d 取樣，分別進行酒精度、總糖、總酸的檢測，其中檢測酒精度所得蒸餾液留樣以測定典型香氣物質(zhì)（正丙醇，異丁醇，異戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯）含量。

1.2.5 理化指標的測定

總糖、總酸、酒精度測定方法參照國標GB/T 13662—2018《黃酒》[8]。

1.2.6 酵母菌數(shù)的測定

采用血球計數(shù)法測定樣品中酵母菌的數(shù)量[9]。

1.2.7 香氣物質(zhì)的測定[10]

色譜柱：DB-FFAP 30 m×0.20 mm×0.25 μm 毛細管色譜柱；柱流量：恒流1.5 mL/min(N2)；進樣口溫度：250 ℃；分流比：25∶1；檢測器(FID)溫度：280 ℃；氫氣：40 mL/min；空氣：400 mL/min；補充氣(N2)：45 mL/min。柱箱溫度：50 ℃(2 min)→(10℃/min)→80 ℃→(20 ℃/min)→150 ℃→(50 ℃/min)→200 ℃(3 min)→(20 ℃/min)→230 ℃(3 min)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用origin 8.0 和excel 進行實驗數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母包埋量對黃酒理化指標的影響

以不同包埋量的固定化黃酒酵母進行發(fā)酵實驗，并取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液進行理化指標的測定，酒精度、總糖、總酸的變化趨勢見圖1—圖5。

從圖1—圖5 可以看出，雖然酒精度、總糖、總酸由于酵母包埋量的不同在數(shù)值上有差異，但總體趨勢是相似的。

酒精度在主發(fā)酵期間快速上升，然后趨于平穩(wěn)，這是因為主發(fā)酵階段酵母大量繁殖，利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生酒精?？偺窃谥靼l(fā)酵階段快速下降，但是由于酵母包埋量的不同，發(fā)酵第1 d的總糖出現(xiàn)了較為明顯的差異，0.2×107個/mL＞0.6×107個/mL＞1.0×107個/mL＞1.4×107個/mL＞1.8×107個/mL，表明酵母包埋量越大，酵母細胞能在發(fā)酵開始時就越快利用糖類物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進行，差距逐漸縮小?？偹崾蔷徛仙淖兓厔?。

表1 列出了不同酵母包埋量發(fā)酵結(jié)束后的理化指標。從表1 看出，發(fā)酵結(jié)束后酵母包埋量為0.2×107個/mL 的總糖含量最高（13.3 g/L），酒精度最低（10.4%vol），包埋量為1.8×107個/mL的酸度最大（4.7 g/L）。酵母包埋量越大，酒精度越高。

2.2 酵母包埋量對黃酒發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)生成量的影響

表1 不同酵母包埋量發(fā)酵結(jié)束后的理化指標

發(fā)酵結(jié)束后各香氣物質(zhì)生成量的差異如圖6所示。從圖6 可以看出，酵母包埋量對醇類物質(zhì)的生成影響較大，酵母包埋量為0.2×107個/mL 生成的正丙醇、異丁醇、β-苯乙醇最多，酵母包埋量為1.8×107個/mL生成的異戊醇含量最高，這可能是因為酵母包埋量小時，酵母增殖倍數(shù)增多，醇類物質(zhì)生成增多，而酵母包埋量大時，則酵母基數(shù)大，繁殖多，生成的醇類也越多。

酵母包埋量對乙醛生成量的影響較大，0.6×107個/mL 生成量最大；酵母包埋量為1.0×107個/mL的乙酸生成量最多，其他4 個水平之間差異不明顯；酵母包埋量為1.0×107個/mL 的生成乙酸乙酯量最大；酵母包埋量為1.0×107個/mL 的生成乳酸乙酯的量最大。由此可見，酵母包埋量為1.0×107個/mL較適合酵母生成酯類物質(zhì)。

圖7 表明了不同酵母包埋量發(fā)酵過程中醇類、酯類總量的變化趨勢，圖8 表明了發(fā)酵結(jié)束后醇類與酯類含量的比值。

圖7 可以看出，酵母包埋量為0.2×107個/mL 生成的醇類總量最多（621.26 mg/L），而酯類總量酵母包埋量為1.0×107個/mL（119.59 mg/L）明顯要高于其他4 個水平，其他4 個水平之間差異不明顯（62.39～68.66 mg/L）。圖8 表明酵母包埋量為0.2×107個/mL和1.8×107個/mL時醇味更重，而酵母包埋量為1.0×107個/mL 發(fā)酵的黃酒醇酯比最?。?.77），醇香清雅，酯香味較強，香氣更加協(xié)調(diào)適中。

從圖9 可以看出，酵母包埋量為0.2×107個/mL的香氣K 值最大（12.87），產(chǎn)生的香氣強度大，其次是包埋量為1.0×107個/mL（11.64）。鑒于酵母包埋量為0.2×107個/mL 時，酒精度偏低（10.4%vol），因此綜合考慮理化指標和香氣物質(zhì)生成量，酵母包埋量為1.0×107個/mL 是固定化條件下理想的酵母包埋量。

3 結(jié)論

通過實驗結(jié)果表明，黃酒酵母包埋量越大，酒精度越高。發(fā)酵結(jié)束后酵母包埋量為0.2×107個/mL發(fā)酵的黃酒酒精度較低（10.4%vol），包埋量為1.8×107個/mL 時黃酒酸度較大（4.7 g/L），這兩種酵母包埋量不適合黃酒發(fā)酵。

酵母包埋量為1.0×107個/mL 生成的酯類總量明顯高于其他4 個水平，其他4 個水平之間差異不明顯，并且酵母包埋量為1.0×107個/mL 發(fā)酵的黃酒醇酯比較小（3.77），同時香氣K 值較大（12.87），香氣強度大，在固定化條件下是理想的酵母包埋量。