董喬娟，于文娟，許 玲，姜明慧，于盼盼，楊慶振，白秀彬，趙紀文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

傳統(tǒng)大曲生產與白酒釀造為開放性的固態(tài)發(fā)酵方式，從而形成了“多微共酵”的發(fā)酵體系，是影響白酒風格和品質的重要基礎。對于白酒釀造微生物的研究，多集中于功能微生物的分離、篩選、鑒定及應用。在白酒釀造中大量寶貴的微生物資源，對后期應用生產實驗，穩(wěn)定并提高白酒的風格和品質提供基礎與保障[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 供試材料

扳倒井高溫大曲、扳倒井發(fā)酵酒醅、扳倒井窖泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌分離培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂；酵母菌、霉菌分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基；細菌保藏培養(yǎng)基：同細菌分離培養(yǎng)基；酵母菌保藏培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；霉菌保存培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基；細菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%；酵母菌種子培養(yǎng)基：玉米糖化液；麩皮固體培養(yǎng)基；細菌液體培養(yǎng)基：同細菌種子培養(yǎng)基；酵母菌液體培養(yǎng)基：麥芽浸粉肉湯；霉菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%。

1.1.3 儀器設備

HIRAYAMA HVE-50 立式自動滅菌器、ESCO CLASSII BSC AC2-6S1 生物安全柜、Bio-Cinerator紅外接種環(huán)滅菌器、QL-901 振蕩器、江蘇太倉DHZ-CA大容量振蕩器、上海一恒GPH-9160"隔水式恒溫培養(yǎng)箱、上?；芫GDHG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱、上海博迅HHS-21-8 數顯恒溫水浴鍋、普析通用T6 新世紀紫外可見分光光度計、OLYMPUSCX41 光學顯微鏡、德國Eppendorf 5424R 型高速冷凍離心機、德國Biometra Tone 96 型臺式PCR擴增儀、君意東方JY330C 瓊脂糖凝膠電泳儀、君意東方JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化

微生物的分離培養(yǎng)采用稀釋平板涂布法。準確稱取25 g 樣品，置入裝有225 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min，放入30 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min。

用移液槍吸取1 mL 震蕩均勻的菌懸液，置入裝有9 mL 無菌水的試管中，振蕩均勻，進行系列稀釋，依次稀釋到10-6。選取10-3、10-4、10-5、10-64 個稀釋梯度分別在營養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅平板上進行涂布，營養(yǎng)瓊脂平板于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h；孟加拉紅平板于28 ℃下倒置培養(yǎng)2～3 d。

培養(yǎng)結束后，挑取平板上生長出的單菌落，繼續(xù)進行多次劃線等純培養(yǎng)操作，直至平板上菌落形態(tài)單一為止。編號，接種于斜面試管中保藏[3]。

1.2.2 菌株的形態(tài)特征觀察

宏觀形態(tài)觀察：將細菌接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落特征；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落特征；將霉菌接種到察氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落特征。

微觀形態(tài)觀察：將細菌接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，用接種環(huán)挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×100 倍油鏡下進行觀察；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，用接種環(huán)挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×40 倍顯微鏡下進行觀察；將霉菌接種到察氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，取1 滴棉蘭染色液置于載玻片中央，用透明膠帶在菌落邊緣粘取少量菌體，覆于染色液上，置于10×40 倍顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 菌株的分子生物學鑒定

DNA 的提取使用天根基因組DNA 提取試劑盒。細菌采用16S rDNA 分子生物學鑒定，引物設計為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；酵母菌采用ITS 分子生物學鑒定，引物設計為ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；霉 菌 采用BT 分子生物學鑒定，引物設計為Bt2a：5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'和Bt2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。利用PCR 擴增技術分別對16S rDNA、ITS 和BT 進行擴增后送樣測序，測序工作由上海生工完成。

1.2.4 菌株的凍干管制備及入庫保藏

以脫脂牛奶為保護劑，將篩選得到的高酶活菌株和抗逆菌株進行凍干管制備，保存至扳倒井微生物菌種資源庫，相關菌種信息錄入扳倒井微生物菌種信息管理系統(tǒng)。

1.2.5 高酶活菌株的篩選

取新鮮活化細菌，接種于細菌種子培養(yǎng)基中，以37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)過夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，接種量為5%,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。40 ℃烘干備用。

取新鮮活化酵母菌，接種于酵母菌種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min 搖床培養(yǎng)過夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，接種量為10%,于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，40 ℃烘干備用。

霉菌直接挑取菌體接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，40 ℃烘干備用。

淀粉酶活力測定方法：稱取10 g 麩曲置于250 mL 燒杯中，加入180 mL 蒸餾水和20 mL 的pH5.5 磷酸緩沖液，攪拌均勻，35 ℃水浴鍋中浸提1 h，濾紙過濾。取9 mL 1.0%淀粉緩沖液（50 ℃，預熱5 min）→加1 mL酶液（立即計時，50 ℃恒溫水浴準確反應30 min）→迅速吸取0.5 mL 反應液于裝有1.5 mL DNS 溶液中（采用25 mL 具塞比色管）→煮沸15 min，冷卻，加10.5 mL 蒸餾水（搖勻）在550 nm波長比色。

蛋白酶活力測定方法：按照SB/T 10317—1999方法進行測定。

脂肪酶活力測定方法：按照GB/T 23535—2009方法進行測定。

1.2.6 耐高溫菌株的篩選

將活化后的細菌，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，分別置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察細菌生長情況。

將活化后的酵母菌，劃線接種于麥芽汁瓊脂平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌生長情況。

將活化后的霉菌，三點接種法接種于察氏培養(yǎng)基平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d，觀察霉菌生長情況。

1.2.7 耐酸菌株的篩選

分別用pH3.0、pH4.0 和pH5.0 緩沖液代替細菌、酵母菌和霉菌液體種子培養(yǎng)基中的蒸餾水，制成pH3、pH4、pH5、pH 自然的細菌、酵母菌、霉菌液體培養(yǎng)基。

將細菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的細菌液體培養(yǎng)基中，以35℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h；將酵母菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的酵母菌液體培養(yǎng)基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h；將霉菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的霉菌液體培養(yǎng)基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。

生長量測定：細菌、酵母菌不同pH 值下生長量測定采用比濁法，以各自對應pH 值的空白培養(yǎng)基為對照，在波長600 nm 下用比色管測定培養(yǎng)液的吸光度值OD600；霉菌不同pH 值下生長量測定采用稱干重法：將培養(yǎng)液用濾紙過濾，少量水洗滌，烘箱80 ℃下烘干，稱菌絲干重。

2 結果與分析

2.1 扳倒井釀酒微生物的分離篩選及鑒定結果

通過分離和多次分純對比，結合菌落外觀和鏡檢觀察，從扳倒井大曲、酒醅及窖泥中初步分離得到61 株細菌、19 株酵母菌和32 株霉菌，其中83 株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

細菌主要為地衣芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、普通高溫放線菌、枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、淤泥大洋芽孢桿菌、韓國芽孢八疊球菌、沙福芽孢桿菌、泛菌屬、短桿菌屬等；酵母菌主要為扣囊復膜孢酵母、異常威克漢姆酵母、伯頓絲孢畢赤酵母、庫德畢赤酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、奇異釀酒酵母；霉菌主要為謝瓦散囊菌、黑曲霉、米根霉、繩狀青霉、產黃青霉、金灰青霉、煙曲霉、溜曲霉、聚多曲霉、宛氏擬青霉、泡盛曲霉、雪白絲衣霉等。

2.2 高酶活菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至麩皮固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結束后40 ℃烘干，分別測定其蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，結果見表1—表4。

2.3 耐高溫菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至平板上，分別置于不同溫度下靜置培養(yǎng)，篩選出耐高溫（55 ℃）菌株15株，結果見表5。

2.4 耐酸菌株的篩選

將112 株菌種分別接種至不同pH 值的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結束后測定其生長量，篩選出1 株耐酸（pH3）細菌琥珀葡萄球菌（保藏編號BDJ20103），其余19株酵母菌和32株霉菌均耐pH3.0。

3 結論

本試驗利用梯度稀釋法和劃線純化法，對扳倒井大曲、酒醅及窖泥中的微生物進行全面的分離純化，共得到112 株菌種，包括61 株細菌、19 株酵母菌和32株霉菌，其中83株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

表1 高產中性蛋白酶菌株篩選結果

表2 高產脂肪酶菌株篩選結果

通過形態(tài)觀察和16S rDNA、ITS 及BT 序列測定，對112 株菌種進行鑒定。并對其進行凍干管制作，保藏至扳倒井微生物菌種資源庫。

對112 株菌種麩皮培養(yǎng)物的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力進行測定，篩選出高產淀粉酶菌株21株、高產中性蛋白酶菌株16 株、高產酸性蛋白酶菌株6株、高產脂肪酶菌株20株。

對112 株菌種在不同溫度下的生長情況進行測定，篩選出耐55 ℃的菌株15株。

表4 高產酸性蛋白酶菌株篩選結果

表5 耐高溫(55 ℃)菌株篩選結果

對112 株菌種在不同pH 值液體培養(yǎng)基中的生長情況進行測定，篩選出耐pH3 的細菌1 株、酵母菌19株、霉菌32株。

在后續(xù)試驗中，將進行耐稀氧、耐酒精等抗逆性能的篩選；并進一步對篩選出的菌株進行單菌株和復合菌株的小型發(fā)酵試驗，以篩選出適合大曲生產和白酒釀造的優(yōu)良功能微生物菌株和復合菌劑。