姚雯菲，許立新

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]，臨床致死率超過20%[2]，各種抑制早期炎癥的手段效果不明顯。1999年，Wang等[3]在膿毒癥動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了一種晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，既可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，自身也作為晚期炎癥介質(zhì)參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]。有研究結(jié)果顯示，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)可通過Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞HMGB1轉(zhuǎn)錄，且促進(jìn)HMGB1乙酰化和核易位[5-6]。我們猜測膿毒癥的關(guān)鍵分子STAT1可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。但是STAT1如何調(diào)控HMGB1的轉(zhuǎn)錄過程目前尚不清楚，為了驗(yàn)證此問題，我們利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子上含有多個(gè)STAT1的結(jié)合元件；本研究使用siRNA抑制STAT1表達(dá)，探討STAT1對HMGB1 轉(zhuǎn)錄水平的影響；構(gòu)建小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子(全長和各截短)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，將上述熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，探討STAT1對HMGB1基因啟動(dòng)子活性影響的區(qū)域；利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)分析STAT1與HMGB1啟動(dòng)子的結(jié)合情況，為今后深入研究膿毒癥HMGB1基因提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人腎上皮細(xì)胞株293T為廣州市第一人民醫(yī)院麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。高純總RNA快速提取試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。熒光素酶雙報(bào)告載體質(zhì)粒(pGL3-Basic和pRL-SV40)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試劑盒購自美國Promega公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、PCR引物購自美國Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo公司。RAW264.7-pcDNA3、RAW264.7-siRNA-STAT1-1、RAW264.7-siRNA-STAT1-2細(xì)胞株、siRNA-STAT1-1質(zhì)粒、siRNA-STAT1-2質(zhì)粒、pGL3-basic質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量檢測HMGB1 mRNA 小鼠細(xì)胞株RAW264.7、RAW264.7-pcDNA3、RAW264.7-siRNA-STAT1-1、RAW264.7-siRNA-STAT1-2分別培養(yǎng)在含DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。采用Trizol法提取各細(xì)胞的總RNA，完成后使用cDNA合成試劑盒，將上述RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后制備qPCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至總體積20 μL，離心使反應(yīng)液充分混勻。以Actb為內(nèi)參，上游引物序列5’-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3’，下游引物序列5’-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’；HMGB1上游引物序列5’-GCTAGTCTTTTGCTTTGCCCA-3’，下游引物序列5’-TGATCACTCCTTGCTTTGCC-3’。qPCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。使用2-△△Ct的計(jì)算方法計(jì)算HMGB1 基因的表達(dá)量。

1.2.2設(shè)計(jì)小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子(全長和各截短)引物序列并擴(kuò)增 在基因庫數(shù)據(jù)庫中，搜索小鼠HMGB1 DNA序列( GenBank_ID：15289)，尋找該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG，由此向上游確定一段序列。利用Primer 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)HMGB1基因啟動(dòng)子區(qū)(-1700～+100bp)的引物，應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站PROMO2.0和LASAGNA-Search 2.0預(yù)測HMGB1基因啟動(dòng)子STAT1可能的結(jié)合元件，根據(jù)預(yù)測結(jié)果和以不中斷轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為原則設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增啟動(dòng)子各截短片段。引物序列見表1，其中下劃線分別代表KpnⅠ and HindⅢ酶切位點(diǎn)。以小鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子序列(全長和各截短)。PCR擴(kuò)增條件，94℃預(yù)變性5 min，95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次后，75℃終延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行割膠純化。

1.2.3構(gòu)建與鑒定小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長和截短質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和 HindⅢ 雙酶切pGL3-basic以及上述PCR產(chǎn)物，回收目的片段。將上述兩種回收產(chǎn)物用重組酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR結(jié)果篩選出陽性克隆質(zhì)粒，再送廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司測序鑒定。鑒定正確后，將構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pGL3-HMGB1-P1800、pGL3-HMGB1-P1300、pGL3-HMGB1-P800、 pGL3-HMGB1-P400，以下簡稱為P1800、P1300、P800、P400。

表1 擴(kuò)增小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子 (全長和截短)引物序列

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將293T細(xì)胞接種于24孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑將(STAT1)分別與上述HMGB1啟動(dòng)子全長和各截短質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，其中各組均共轉(zhuǎn)染pRL-TK作為轉(zhuǎn)染率內(nèi)參照(10∶10∶1)，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pGL3空質(zhì)粒(pGL3-basic)組作為對照。

1.2.5測定熒光素酶的活性 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h，PBS輕柔洗滌2次，加入裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解物于管中。用雙熒光素酶報(bào)告基因測試劑盒，分別對HMGB1基因啟動(dòng)子全長和各截短表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒的熒光素酶活性進(jìn)行測定，具體操作詳見試劑說明書。測定目的基因的螢火蟲熒光素酶活性(標(biāo)記M1)，內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒的海腎熒光素酶活性(標(biāo)記為M2)，被測質(zhì)粒的相對熒光素酶活性(relative luciferase activity，RLU)即M1/M2。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.6染色質(zhì)免疫共沉淀 培養(yǎng)293T細(xì)胞株，待細(xì)胞生長覆蓋率為 80%～90%時(shí)，冰PBS洗3次，用1%甲醛交聯(lián)10 min，加甘氨酸中和甲醛，冰PBS重復(fù)洗3次。37 ℃孵育 20 min。超聲破碎細(xì)胞后離心，取上清并分為實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組。實(shí)驗(yàn)組加入Anti-STAT1抗體，陰性對照組加入非特異性IgG，4 ℃孵育過夜，待抗體與STAT1-DNA 復(fù)合物相互結(jié)合后，加入ProteinG 磁珠，沉淀抗體STAT1-DNA 復(fù)合物，并對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗。洗脫，得到可能富集STAT1-DNA 的復(fù)合物，解交聯(lián)，用 DNA 純化柱純化并富集被沉淀下來的 DNA 片段，對HMGB1啟動(dòng)子DNA 進(jìn)行PCR 分析。應(yīng)用HMGB1基因啟動(dòng)子-1700～-700bp特異性引物：上游引物序列5’-GCTAGTCTTTTGCTTTGCCCA-3’，下游引物序列5’-TGATCACTCCTTGCTTTGCC-3’。SYBR green染色方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抑制STAT1表達(dá)對HMGB1 mRNA的影響

qPCR法鑒定空載組NC、抑制組siRNA-STAT1、抑制組siRNA-STAT2細(xì)胞株中HMGB1的mRNA的表達(dá)量。圖1顯示，與NC比較， siRNA-STAT1-1、siRNA-STAT1-2細(xì)胞中HMGB1的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。表明抑制STAT1表達(dá)能抑制HMGB1 mRNA的表達(dá)量，即STAT1能上調(diào)HMGB1的轉(zhuǎn)錄水平。

2.2 小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長及各截短質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.2.1小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子截短位置的確定 應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站PROMOTER2.0和LASAGNA-Search 2.0進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，在HMGB1啟動(dòng)子區(qū)域共含有7個(gè)可能的STAT1結(jié)合元件，具體序列和位置見表2。據(jù)此設(shè)計(jì)了3對引物以及擴(kuò)增HMGB1基因啟動(dòng)子各截短序列，引物序列見表1。設(shè)計(jì)的HMGB1基因啟動(dòng)子全長和各截短的長度分別為1800bp(-1700～+100bp)、1300bp(-1200～+100 bp)、800bp(-700～+100 bp)、400bp(-300～+100 bp)。

注：與NC組比較，*P<0.05

圖1 siRNA-STAT1對HMGB1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

表2 小鼠HMG1 啟動(dòng)子區(qū) STAT1的結(jié)合元件預(yù)測

2.2.2小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長及各截短質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長和各截短引物，以小鼠基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增HMGB1基因啟動(dòng)子全長及各截短片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖2。將擴(kuò)增回收產(chǎn)物插入pGL3-basic質(zhì)粒中。重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化涂板以及挑單克隆搖菌后，進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，篩選出陽性克隆(圖3)，送測序。與小鼠HMGB1啟動(dòng)子序列比對，顯示序列及插入方向正確。上述結(jié)果顯示小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長和各截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)研究。

圖2 PCR擴(kuò)增HMGB1基因啟動(dòng)子全長及各截短片段結(jié)果 M為Marker 1為擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 HMGB1全長及各截短質(zhì)粒雙酶切結(jié)果 M為Marker 1為pGL3質(zhì)粒 2為雙酶切結(jié)果

2.3 STAT1對小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子全長和截短活性的影響

將pGL3-Basic、HMGB1基因啟動(dòng)子全長P1800和各截短P1300、P800、P400熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與pcDNA3.1-STAT1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測各組熒光素酶活性。由圖4可見，與空載體組相比，全長啟動(dòng)子P1800和截短啟動(dòng)子P1300熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)；與空載體組相比，截短啟動(dòng)子P800和截短啟動(dòng)子P400熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明STAT1能顯著提高HMGB1基因啟動(dòng)子-1700～-700 bp之間的熒光素酶活性，STAT1可能與HMGB1基因啟動(dòng)子-1700～-700bp區(qū)域結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控HMGB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。HMGB1啟動(dòng)子-700～+100 bp之間的熒光素酶活性與空載體比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即在STAT1可能沒有在此區(qū)域與HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控其活性。

2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀

加入STAT1抗體 的Anti-STAT1組的 HMGB1表達(dá)量較 IgG陰性對照組明顯升高(P<0.05)，見圖5。根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，STAT1可能與HMGB1啟動(dòng)子-1700～-700bp區(qū)域結(jié)合，據(jù)小鼠HMGB1基因啟動(dòng)子-1700～-700bp序列設(shè)計(jì)PCR引物，Input對照以沒有進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)的DNA為模板，陰性對照以鼠IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，STAT1抗體免疫沉淀的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖6所示，Input對照和Anti-STAT1的實(shí)驗(yàn)組有目的擴(kuò)增條帶，陰性對照未檢測到目的擴(kuò)增條件。進(jìn)一步驗(yàn)證STAT1可與HMGB1基因啟動(dòng)子-1700～-700bp區(qū)域DNA序列直接結(jié)合。

注：與空載體組比較，*P<0.05

圖4 HMGB1基因啟動(dòng)子全長和各截短熒光素酶活性

注：與IgG陰性對照組比較，*P<0.05

圖5 STAT1與HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合的染色質(zhì)免疫共沉淀驗(yàn)證結(jié)果

圖6 染色質(zhì)免疫共沉淀-PCR檢測HMGB1啟動(dòng)子結(jié)果

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機(jī)制是炎癥因子釋放的級聯(lián)反應(yīng)，HMGB1作為重要的晚期炎癥介質(zhì)，一方面通過自身的毒性作用，另一方面和炎癥因子相互作用放大炎癥反應(yīng)，使膿毒癥進(jìn)一步加重。膿毒癥患者血漿中的HMGB1濃度高于正常者，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[7]。因此減少或抑制HMGB1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和釋放，可能有利于治療膿毒癥。

在膿毒性休克小鼠中，STAT1基因敲除鼠存活率明顯高于野生組鼠，這說明STAT1在膿毒癥中發(fā)揮重要作用[8]。大量研究結(jié)果顯示，在膿毒癥中JAK/STAT信號通路對激活HMGB1轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵作用[9,10]，此外，SIRT1/STAT信號通路對HMGB1轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和釋放也有促進(jìn)影響[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究STAT1對HMGB1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。首先利用siRNA抑制STAT1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)HMGB1 轉(zhuǎn)錄水平明顯下降；為進(jìn)一步探討STAT1對HMGB1啟動(dòng)子作用的區(qū)域，我們利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)，以不中斷轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為原則，篩選STAT1與HMGB1的結(jié)合區(qū)域，設(shè)計(jì)構(gòu)建了HMGB1基因啟動(dòng)子全長及各截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒分別與STAT1重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，P1800和P1300啟動(dòng)子熒光素酶活性顯著高于空載體組，提示STAT1可能與HMGB1啟動(dòng)子上-1700～-700bp區(qū)域結(jié)合，從而提高啟動(dòng)子的活性；而P800和P400組與空載體組無明顯差異，提示在HMGB1啟動(dòng)子-800～+100bp區(qū)域，STAT1沒有發(fā)揮調(diào)控啟動(dòng)子活性的作用，推測STAT1在此區(qū)域沒有和HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，STAT1能與HMGB1啟動(dòng)子-1700～-700bp區(qū)域直接結(jié)合。不過，STAT1與HMGB1具體的結(jié)合元件須通過啟動(dòng)子突變實(shí)驗(yàn)才能準(zhǔn)確定位。另外，目前并不清楚在膿毒癥中，除了STAT1之外，是否存在其他轉(zhuǎn)錄因子直接參與調(diào)節(jié)HMGB1的表達(dá)，這值得進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了STAT1能通過與HMGB1基因的啟動(dòng)子-1700～-700bp區(qū)域直接結(jié)合從而上調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平。