劉中原 劉 崢 徐 穎 劉珊珊 田志蘭 解慶軍 高彩球

(東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040)

自然界中，植物不斷受到高溫、干旱、鹽漬等非生物逆境脅迫，由于植物固生于土壤中，故在漫長的進(jìn)化過程中植物自身形成了一個(gè)高效的逆境脅迫響應(yīng)和逆境應(yīng)答機(jī)制，從而使植物能在各種逆境條件下做出應(yīng)答并生存。因此，研究植物逆境表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)揭示植物抗逆機(jī)制至關(guān)重要。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, HSF)被證實(shí)是廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因。從最早Scharf等(1990)在番茄(Lycopersiconesculentum)中研究HSF基因以來，大量的HSF基因從各種植物中相繼得到分離和鑒定，如在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)、胡蘿卜(Daucuscarota)、大豆(Glycinemax)、小麥(Triticumaestivum)中分別鑒定出21、24、25、24、35、52、56個(gè)HSF家族成員(Guoetal., 2008; 2015; Chungetal., 2013; Wangetal., 2014; Zhouetal., 2013; Huangetal., 2015; Linetal., 2011)。HSF蛋白的分子結(jié)構(gòu)具有4個(gè)代表性的重要結(jié)構(gòu)域： DNA結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD)、寡聚化結(jié)構(gòu)域 (oligomerization domain, OD)、核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS)，及有些HSF具有的C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)。HSF的DBD和OD結(jié)構(gòu)域是最為保守的區(qū)域。DBD由3個(gè)α-螺旋(α1、α2和α3)和4個(gè)β-折疊(β1、β2、β3和β4)組成。根據(jù)OD在區(qū)域A與B之間氨基酸的插入個(gè)數(shù)可將植物HSFs分為A、B和C 3類，其中A和C類分別在區(qū)域A與B之間插入21個(gè)和7個(gè)氨基酸，而B類HSFs結(jié)構(gòu)無氨基酸插入(Dambergeretal., 1994)。

白樺是一種落葉喬木，在亞洲東部廣泛分布。喜光，耐嚴(yán)寒，生命力極強(qiáng)，在恢復(fù)森林、維護(hù)森林的生態(tài)效益中起重要作用，同時(shí)其木材紋理直、結(jié)構(gòu)細(xì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于近年來環(huán)境不斷惡化，鹽漬化土地面積越來越大，對(duì)白樺的栽培和推廣造成困難。因此，培育耐鹽白樺新品種具有重要的意義。本研究從白樺中克隆獲得1條HSFA4基因，利用qRT-PCR分析了白樺受不同非生物脅迫(高鹽、干旱、鎘、熱、冷)和激素處理(ABA、GA3、JA)下HSFA4在根、莖和葉中的表達(dá)情況。為進(jìn)一步探究BpHSFA4基因是否具有耐鹽功能，構(gòu)建了HSFA4基因過表達(dá)載體(pROKⅡ-HSFA4)和抑制表達(dá)載體(pFGC5941-HSFA4)，并獲得了瞬時(shí)過表達(dá)和抑制表達(dá)HSFA4基因白樺，分析比較了過表達(dá)、抑制表達(dá)HSFA4基因白樺與對(duì)照白樺(轉(zhuǎn)pROKⅡ空載)在鹽脅迫下的組織化學(xué)染色及生理指標(biāo)的變化，以初步鑒定HSFA4基因的耐鹽功能。本研究可為深入探究白樺HSFA4基因的耐鹽功能及其機(jī)制，以及利用基因工程手段提高植物尤其是林木的耐鹽能力奠定理論基礎(chǔ)，并提供基因材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

植物材料的種植與脅迫處理參照Liu等(2018)，具體步驟為： 將野生白樺種子均勻撒播于泥炭土、蛭石和珍珠巖4∶4∶1 (V/V/V)的混合基質(zhì)中，置于室溫25 ℃、相對(duì)濕度70%～75%、14 h光照/10 h黑暗的溫室中。將2月齡生長勢一致的白樺幼苗分為6組，分別用0.2 mol·L-1NaCl、20% (200 g·L-1) PEG6000、150 μmol·L-1CdCl2、100 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1JA溶液對(duì)幼苗進(jìn)行根部澆灌脅迫處理，處理時(shí)間為6、12、24、48、72 h，同時(shí)以正常澆水的白樺材料作為對(duì)照。另外，取同一批長勢相同的白樺幼苗分別置于4 ℃和37 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷熱處理(25 ℃處理作為對(duì)照)，處理時(shí)間為6、12、24、48、72 h。脅迫處理后分別取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的白樺根、莖、葉組織，經(jīng)液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 白樺HSFA4基因的克隆和序列分析

從白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得1條HSFA4基因(命名為BpHSFA4)，在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行序列比對(duì)和ORFFinder查找以確定HSFA4基因是否具有完整開放閱讀框。根據(jù)BpHSFA4基因序列，設(shè)計(jì)引物(表1)，以白樺葉cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得該基因，克隆進(jìn)pMD?18-T載體，測序驗(yàn)證所克隆的BpHSFA4基因序列。對(duì)克隆獲得的BpHSFA4基因進(jìn)行序列分析。使用在線工具ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)推導(dǎo)BpHSFA4基因編碼蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點(diǎn)。在NCBI上對(duì)白樺BpHSFA4蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，選取與白樺BpHSFA4蛋白同源性較高的19種植物的HSFA4蛋白序列，利用BioEdit7.0.9軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，具體操作參考Hall(1999)，并利用MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)預(yù)測系統(tǒng)發(fā)生樹，采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析，具體操作參考Tamura等(2011)。這19種植物分別是栓皮櫧(Quercussuber)、核桃(Juglansregia)、土瓶草(Cephalotusfollicularis)、蓖麻(Ricinuscommunis)、木薯(Manihotesculenta)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)、毛果楊(Populustrichocarpa)、克萊門柚(Citrusclementina)、胡楊(Populuseuphratica)、甜橙(Citrussinensis)、可可(Theobromacacao)、榴蓮(Duriozibethinus)、野大豆(Glycinesoja)、番木瓜(Caricapapaya)、醉蝶花(Tarenayahassleriana)、相思子(Abrusprecatorius)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、杭白菊。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

利用RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司BioTeke)提取各處理時(shí)間點(diǎn)的白樺根、莖和葉的總RNA。按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit (TaKaRa)試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作qRT-PCR反應(yīng)模板。選擇白樺微管蛋白基因(Tubulin，登錄號(hào)： FG067376)和泛素基因(Ubiquitin，登錄號(hào)： FG065618)作為內(nèi)參基因。內(nèi)參和BpHSFA4基因的qRT-PCR引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括稀釋后的模板2 μL、基因特異性上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性30 s； 94 ℃變性12 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，80 ℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，qRT-PCR進(jìn)行了3次獨(dú)立的試驗(yàn)(Liuetal., 2018)?；虮磉_(dá)量分析采用2-△△Ct法(Livaketal., 2001)。

1.4 BpHSFA4基因植物過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)植物過表達(dá)載體pROKⅡ的多克隆位點(diǎn)和BpHSFA4基因特征，在設(shè)計(jì)引物時(shí)于BpHSFA4基因5′端和3′分別添加了XbaⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(引物見表1)。將以白樺cDNA為模板克隆獲得的BpHSFA4基因插入到XbaⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間(圖1A)。通過單克隆PCR和測序驗(yàn)證，獲得BpHSFA4基因過表達(dá)載體，命名為pROKⅡ-BpHSFA4，轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株EHA105中。將構(gòu)建好的EHA105(pROKⅡ-BpHSFA4)保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

抑制表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)先構(gòu)建pFGC5941-BpHSFA4-Cis，根據(jù)植物抑制表達(dá)載體pFGC5941的多克隆位點(diǎn)及BpHSFA4基因的特征，在BpHSFA4基因5′端和3′端分別添加AscⅠ和SwaⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物(表1)。進(jìn)而以pROKⅡ-BpHSFA4質(zhì)粒為模板，pFGC5941-BpHSFA4-Cis-F/R為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增帶有AscⅠ和SwaⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的目的基因。通過酶切，連接后重組載體為pFGC5941-BpHSFA4-Cis，進(jìn)而轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)，檢測正確后，保存?zhèn)溆?。再以pFGC5941-BpHSFA4-Cis為基礎(chǔ)，在XbaⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間插入BpHSFA4-Anti鏈，通過單克隆PCR和測序驗(yàn)證，獲得BpHSFA4基因抑制表達(dá)載體(圖1B)，命名為pFGC5941-BpHSFA4，轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株EHA105。將構(gòu)建好的EHA105(pFGC5941-BpHSFA4)保存在-80 ℃。

表1 qRT-PCR和載體構(gòu)建的引物序列

圖1 植物過表達(dá)載體pROKⅡ-BpHSFA4(A)和抑制表達(dá)載體pFGC5941-BpHSFA4(B)的構(gòu)建圖譜

1.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺的獲得及耐鹽功能分析

根據(jù)Liu等(2018)和Zhang等(2012)的方法將構(gòu)建好的EHA105(pROKⅡ-BpHSFA4)、EHA105(pFGC5941-BpHSFA4)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對(duì)照)分別瞬時(shí)侵染白樺，分別標(biāo)記為OE、SE和CK。分析比較鹽脅迫后瞬時(shí)過表達(dá)、抑制表達(dá)BpHSFA4基因白樺和對(duì)照白樺的鹽脅迫相關(guān)生理生化指標(biāo)，以初步探究BpHSFA4基因是否具有耐鹽功能及其可能參與的生理調(diào)控通路。具體的步驟為:將生長30～40天白樺組培苗放入轉(zhuǎn)化液中，25 ℃ 90 r·min-1培養(yǎng)3 h后，快速將苗轉(zhuǎn)移至洗滌液中，復(fù)水90 s，再用無菌濾紙吸干菌液轉(zhuǎn)移至共同培養(yǎng)培養(yǎng)基。共培養(yǎng)48 h后，將3種白樺轉(zhuǎn)基因株系分別轉(zhuǎn)移至含150 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上。將鹽脅迫處理0、2 h后的瞬時(shí)侵染白樺苗置于50 mL離心管中，分別加入20 mL二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和伊文思藍(lán)(Evans blue)染色液，室溫染色3～5 h。染色結(jié)束后，用75%(V/V)乙醇+5%(V/V)甘油沸水浴脫色(Zhangetal., 2011; Kimetal., 2003; Liuetal., 2018)。此外，收集脅迫處理12、24、36 h后的白樺幼苗，進(jìn)行生理指標(biāo)分析(Zhangetal., 2018; Liuetal., 2018)。同時(shí)以正常MS培養(yǎng)白樺轉(zhuǎn)基因株系作為對(duì)照。每次試驗(yàn)至少包含9株白樺幼苗，并重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpHSFA4基因的克隆及序列分析

BpHSFA4基因cDNA長度為1 170 bp，具有完整的開放讀碼框，編碼389個(gè)氨基酸，編碼蛋白的相對(duì)分子量(molecular weight)為44.15 kDa，理論等電點(diǎn)(theoretical pI)為5.14。BpHSFA4蛋白具有典型HSF結(jié)構(gòu)域。選擇19種與白樺BpHSFA4蛋白同源性較高的已知HSFA4蛋白序列，利用BioEdit軟件和MEGA軟件分別進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示20種植物的HSFA4蛋白序列均有保守的HSF結(jié)構(gòu)域(圖2A)。氨基酸序列一致性在68%～79%，其中白樺BpHSFA4蛋白與杭白菊(79%)、栓皮櫧(79%)、土瓶草(71%)的HSFA4蛋白的同源性較高。進(jìn)化樹分析結(jié)果也顯示，白樺與杭白菊、栓皮櫧、土瓶草親緣關(guān)系較近，歸為一組(圖2B)。

圖2 白樺BpHSFA4蛋白與其他19種植物HSFA4蛋白的多序列比對(duì)(A)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(B)

2.2 不同脅迫處理下BpHSFA4基因的表達(dá)模式分析

2.2.1 非生物脅迫處理下BpHSFA4基因的表達(dá)模式 為了初步分析BpHSFA4基因能否對(duì)各種非生物脅迫逆境做出應(yīng)答，利用qRT-PCR分析了鹽、干旱、鎘、高溫和低溫脅迫處理后白樺BpHSFA4基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示： NaCl脅迫下BpHSFA4在白樺根、莖和葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)。葉中，BpHSFA4在脅迫初期(12 h)表達(dá)量變化不明顯，隨后上調(diào)表達(dá)，至脅迫48 h達(dá)到最高表達(dá)水平； 莖中，脅迫24 hBpHSFA4基因表達(dá)水平達(dá)到最高，為對(duì)照的58.1倍； 根中，脅迫24 h前均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，脅迫6 h達(dá)到最低表達(dá)水平，48 h后上調(diào)表達(dá)(圖3A)。鎘脅迫下，葉中BpHSFA4基因在整個(gè)脅迫過程中為顯著上調(diào)表達(dá)(除6 h無明顯變化)，24 h表達(dá)達(dá)最高水平； 莖中表達(dá)趨勢與葉中類似，6 h后全部上調(diào)表達(dá)； 而在根中，BpHSFA4基因表達(dá)先下調(diào)隨后上調(diào)，脅迫12 h達(dá)到最低表達(dá)水平，48 h達(dá)最高表達(dá)水平(圖3B)。高溫脅迫下，葉和根中BpHSFA4基因在整個(gè)脅迫過程中均全部被誘導(dǎo)表達(dá)，且都在12 h表達(dá)達(dá)到最高水平； 莖中，BpHSFA4基因在脅迫過程中也受高溫誘導(dǎo)，但表達(dá)量變化不如葉和根中明顯(圖3C)。低溫脅迫下，葉和根中，BpHSFA4基因在整個(gè)脅迫過程中全部被誘導(dǎo)表達(dá)，48 h達(dá)到最高水平； 但在莖中，BpHSFA4基因在整個(gè)脅迫過程中無明顯變化(圖3D)。PEG6000脅迫下，葉中，BpHSFA4基因在所有研究時(shí)間點(diǎn)均為上調(diào)表達(dá)，48 h達(dá)到最高表達(dá)水平； 根中，BpHSFA4基因在脅迫過程中受PEG6000誘導(dǎo)，大部分時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，且在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量增加超過了2倍； 而在莖中，BpHSFA4基因在脅迫過程中無明顯變化(圖3E)。

圖3 非生物脅迫處理下白樺BpHSFA4基因表達(dá)分析

2.2.2 激素處理下BpHSFA4基因的表達(dá)模式 ABA處理后，葉中BpHSFA4基因下調(diào)表達(dá)，并在48 h達(dá)到最低表達(dá)水平； 莖中，BpHSFA4基因在處理前期無明顯表達(dá)，48 h明顯下調(diào)后開始上調(diào)表達(dá)，于72 h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平； 而根中，BpHSFA4基因全部被誘導(dǎo)表達(dá)(圖4A)。GA3處理后，葉中，BpHSFA4基因表達(dá)在脅迫初期不明顯，隨后表達(dá)量逐漸增加，48 h達(dá)到最高表達(dá)水平(為對(duì)照的8.79倍)； 但在莖和根中，與對(duì)照相比，BpHSFA4基因在GA3處理后，表達(dá)量變化不明顯(圖4B)。JA處理后，在葉和莖中BpHSFA4上調(diào)表達(dá)，其中葉中處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)最高水平，為對(duì)照的7.36倍，莖中處理6 h表達(dá)量達(dá)到最高水平； 在根中，6 h達(dá)到最低表達(dá)水平，而在12 h達(dá)到最高表達(dá)水平(圖4C)。

圖4 激素處理下白樺BpHSFA4基因表達(dá)分析

2.3 BpHSFA4 基因耐鹽功能分析

2.3.1 瞬時(shí)表達(dá)白樺的獲得 分別提取3種瞬時(shí)侵染后的轉(zhuǎn)基因白樺株系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR分析3種瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因白樺株系中BpHSFA4基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在非脅迫處理時(shí)(脅迫0 h)，過表達(dá)株系中BpHSFA4基因的表達(dá)量顯著增加，是對(duì)照的3.11倍，而抑制表達(dá)株系則顯著降低，是對(duì)照的58.76%。在150 mmol·L-1NaCl脅迫12、24、36 h后過表達(dá)株系中BpHSFA4基因的表達(dá)量分別是對(duì)照的16.1、16.19、3.83倍，而抑制表達(dá)株系則分別是對(duì)照的17.9%、56.3%、26.8%。表明成功獲得了瞬時(shí)過表達(dá)和抑制表達(dá)BpHSFA4基因白樺株系(圖5)。

圖5 150 mmol·L-1 NaCl脅迫下瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺BpHSFA4基因的表達(dá)

Evans blue可以進(jìn)入細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整或喪失活性的細(xì)胞內(nèi)，并將細(xì)胞染成藍(lán)色。Evans blue染色試驗(yàn)可以通過細(xì)胞染色的深淺判斷轉(zhuǎn)基因白樺細(xì)胞的損傷或死亡情況。與DAB和NBT染色結(jié)果相似，非脅迫條件下，3種轉(zhuǎn)基因植株的染色無明顯差異。但在鹽脅迫條件下，與對(duì)照植株相比，過表達(dá)BpHSFA4植株染色淺，表明細(xì)胞損傷程度較輕、細(xì)胞死亡量較少，而抑制表達(dá)植株染色深，表明細(xì)胞受損程度高、細(xì)胞死亡量較多(圖6C)。

2.3.3 鹽脅迫后3種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺生理指標(biāo)的比較 在無鹽脅迫條件下，過表達(dá)BpHSFA4、抑制表達(dá)BpHSFA4和對(duì)照白樺株系的H2O2含量、MDA含量、SOD活性、POD活性和相對(duì)電導(dǎo)率無顯著差異。但是，NaCl脅迫條件下，過表達(dá)BpHSFA4植株的H2O2含量、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于對(duì)照植株，抑制表達(dá)BpHSFA4植株的H2O2含量、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率則明顯高于對(duì)照植株； 過表達(dá)BpHSFA4植株的SOD和POD活性明顯高于對(duì)照植株，而抑制表達(dá)BpHSFA4植株的SOD和POD活性明顯低于對(duì)照株系(圖7)。表明鹽脅迫條件下，過表達(dá)BpHSFA4基因能提高活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度從而提高耐鹽能力，BpHSFA4基因可能是一個(gè)耐鹽能力優(yōu)良的候選基因。

圖6 150 mmol·L-1NaCl脅迫下白樺轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照NBT、DAB和Evans blue染色比較

圖7 150 mmol·L-1NaCl脅迫下白樺轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照的生理指標(biāo)比較

3 討論

3.1 BpHSFA4基因的結(jié)構(gòu)與逆境脅迫下的表達(dá)

從白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選鑒定出1條HSFA4基因(BpHSFA4)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，其編碼蛋白的N端有保守的HSF結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，BpHSFA4與杭白菊、栓皮櫧、土瓶草蛋白的同源性較高，聚在同一分支。栓皮櫧和土瓶草的HSFA4基因的研究尚未見報(bào)道。而杭白菊中，CmHSFA4通過結(jié)合HSE元件調(diào)控下游相關(guān)基因維持Na+/K+離子穩(wěn)態(tài)平衡和減少ROS的積累從而賦予杭白菊耐鹽能力(Lietal., 2018)。因此，推測BpHSFA4基因可能也具有耐鹽脅迫功能。

進(jìn)一步對(duì)BpHSFA4基因在不同的脅迫處理后白樺各組織中的表達(dá)研究結(jié)果顯示，在不同非生物脅迫下，白樺葉、莖和根中，BpHSFA4基因均能產(chǎn)生不同程度的改變。在鹽和干旱脅迫下，BpHSFA4基因能明顯被誘導(dǎo)表達(dá)，且在葉中表達(dá)趨勢基本一致，都是上調(diào)表達(dá)。可能是由于鹽和干旱脅迫都能對(duì)植物產(chǎn)生滲透脅迫(胡濤等， 2018)，從而誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，但是由于鹽脅迫過程中會(huì)產(chǎn)生離子毒害等現(xiàn)象，故導(dǎo)致其在鹽和干旱脅迫下表達(dá)模式有所不同。在鹽脅迫下BpHSFA4基因與鎘脅迫下的表達(dá)趨勢基本一致，特別在葉和根組織中。這一現(xiàn)象表明BpHSFA4基因可能對(duì)鹽和鎘脅迫具有相同的調(diào)控機(jī)制。同時(shí)研究過程中發(fā)現(xiàn)BpHSFA4基因在ABA激素脅迫下也有明顯的應(yīng)答，表明BpHSFA4基因可能參與了ABA介導(dǎo)的鹽和干旱脅迫應(yīng)答。這些現(xiàn)象為下一步繼續(xù)挖掘BpHSFA4基因的功能提供了新的方向。

3.2 BpHSFA4 基因的抗逆功能

當(dāng)植物遭受逆境脅迫(鹽脅迫)時(shí)可能破壞植物細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生與清除之間的平衡，導(dǎo)致ROS濃度不斷增加，并對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)、DNA和RNA等造成氧化損傷，進(jìn)而抑制植物生長和發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡(Hossainetal., 2015; Jainetal., 2015)。在漫長的進(jìn)化過程中植物為了適應(yīng)環(huán)境變化，自身逐步形成了一個(gè)靈活高效的逆境脅迫響應(yīng)和應(yīng)答機(jī)制，使其能在逆境條件下生存。其中維持體內(nèi)活性氧平衡是植物抵抗逆境脅迫的一個(gè)重要機(jī)制。

鹽脅迫下，植物必須及時(shí)清除體內(nèi)多余的ROS，以維持植物體正常的生命活動(dòng)。在植物體內(nèi)存在2種活性氧清除機(jī)制，其一就是酶促清除系統(tǒng)，主要依靠酶促抗氧化劑來完成。主要有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等。一般會(huì)通過提高SOD和POD酶活性來清除體內(nèi)多余的ROS。在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)HSFA4基因能調(diào)控ROS水平，從而使胡楊達(dá)到脅迫馴化的目的(Zhangetal., 2016)。小麥HSFA4基因通過調(diào)控POD來減少ROS的積累，從而賦予小麥抗氧化和耐熱能力(Goswamietal., 2015)。TaHSFA4和OsHSFA4通過上調(diào)水稻中的金屬硫蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)了水稻對(duì)鎘的耐受性(Perez-Salamoetal., 2014)。在向日葵(Helianthusannuus)中，HaHSFA4和HaHSFA9共表達(dá)激活了smHSP基因的表達(dá)從而導(dǎo)致小熱激蛋白的大量積累，因而增強(qiáng)了向日葵對(duì)脫水的耐受性(Personatetal., 2014)。

鹽脅迫后，植物體內(nèi)產(chǎn)生高水平的活性氧，直接攻擊生物膜，對(duì)植物造成傷害甚至死亡(Hendryetal., 1992)。MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物在逆境脅迫下受傷害的程度。在本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因白樺株系和對(duì)照白樺中MDA含量都呈現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間的延長而逐漸增加的趨勢，但是在整個(gè)脅迫過程中，過表達(dá)BpHSFA4株系MDA含量均明顯低于對(duì)照，抑制表達(dá)BpHSFA4株系MDA含量均明顯高于對(duì)照。Evans blue染色結(jié)果表明： 過表達(dá)BpHSFA4植株中細(xì)胞受損傷程度較輕、細(xì)胞死亡量較少，而抑制表達(dá)植株細(xì)胞受損程度高、細(xì)胞死亡量較多。相對(duì)電導(dǎo)率的測定結(jié)果也與此一致，表明過表達(dá)BpHSFA4株系細(xì)胞膜受損程度低、電解質(zhì)外滲少，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性較高； 抑制表達(dá)BpHSFA4白樺株系則與之相反。

4 結(jié)論

從白樺中克隆獲得了BpHSFA4基因，其cDNA長度為1 170 bp，具有完整的開放讀碼框，編碼389個(gè)氨基酸，編碼蛋白的相對(duì)分子量為44.15 kDa，理論等電點(diǎn)為5.14。白樺BpHSFA4蛋白具有典型HSF結(jié)構(gòu)域。該基因能對(duì)非生物脅迫和激素脅迫做出應(yīng)答。特別是鹽脅迫下，該基因表達(dá)變化明顯，表明其可能參與了鹽脅迫應(yīng)答。150 mmol·L-1NaCl脅迫后，過表達(dá)BpHSFA4轉(zhuǎn)基因白樺株系可通過提高SOD和POD活性，降低MDA和H2O2含量來增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧能力、降低膜脂氧化程度從而減少細(xì)胞受損或死亡，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因白樺的耐鹽能力。后續(xù)研究中，將進(jìn)一步對(duì)該基因的耐鹽機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。