張鳳鴻 上海中維檢測(cè)技術(shù)有限公司 126707

酸棗仁皂苷來(lái)源于為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) H u ex H. F. Chou干燥成熟的種子，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝，寧心安神，斂汗，生津。用于虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口渴的功效[1]。酸棗仁合劑收錄于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊(cè)，由酸棗仁、知母、茯苓、川芎和甘草五味中草藥構(gòu)成[2]，但由于煎煮程序復(fù)雜，因此部分藥廠將這五味或是取其部分中草藥或與其他中草藥配伍做成特殊膳食補(bǔ)充劑，方便服用。其中起主要藥效的是酸棗仁皂苷A，目前對(duì)于酸棗仁皂苷A的檢測(cè)多是集中在單味藥酸棗仁及其提取物的檢測(cè)，利用HPLC[1,3,4]，以及LC-MS-MS方法[5]，然而沒(méi)有對(duì)于酸棗仁合劑及復(fù)方中酸棗仁皂苷A的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)的主要目的是利用HPLC-ELSD建立酸棗仁合劑提取物混合片中酸棗仁皂苷A含量的測(cè)試方法。

1 儀器、試劑和樣品信息

高效液相色譜儀：安捷倫HPLC 1260-安捷倫蒸發(fā)光散射檢測(cè)器380(ELSD)

電子天平：梅特勒XS205DU十萬(wàn)分之一天平

恒溫振蕩水槽：上海一恒，DKZ電熱恒溫振蕩水槽

氮吹儀：安譜，40位

酸棗仁皂苷A ：安譜，98.8%

甲醇： CNW，純度：99.9%，級(jí)別：HPLC

乙腈： J&K 純度：99.9% 級(jí)別：ACS/HPLC

水：Merck Millipore制備的超純水

過(guò)濾膜：安譜，0.45μm有機(jī)濾膜

樣品信息：混合提取物片劑（酸棗仁提取物+知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+輔料（麥芽糊精+玉米淀粉等）)，客戶提供，配比保密。

樣品空白信息：混合提取物片劑（知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+輔料（麥芽糊精+玉米淀粉等），客戶提供，配比保密。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)試條件

儀器名稱：液相色譜質(zhì)譜儀（安捷倫1260-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD））

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18, 4.6×250 mm, 5μm

色譜條件：

柱溫：30°C

流動(dòng)相A：18MΩ超純水

流動(dòng)相B：色譜純乙腈（ACN）

洗脫程序

?

進(jìn)樣程序：吸取速度200μl/min，進(jìn)樣速度200μl/min，吸取樣品量50μl，吸取水量50μl，進(jìn)樣環(huán)內(nèi)混合10次，進(jìn)樣。

蒸發(fā)光散射ELSD檢測(cè)器參數(shù)：

蒸發(fā)溫度：90°C

霧化器溫度：85°C

氮?dú)饬魉伲?.6 SLM

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液制備

稱取酸棗仁皂苷A（ANPEL，98.8%，P1860010）10.45 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度。制得濃度為1032μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液待用。

2.2.2 樣品前處理

樣品用食品破碎機(jī)打碎，稱取1.00克于40mL玻璃瓶中，加入10mL70%的甲醇水溶液，混勻后，旋緊螺紋蓋密封，置于85°C水浴中加熱并振蕩2h。加熱完畢后，冷卻至室溫。精確取1.00mL樣品溶液于氮吹管中，50°C吹至近干，精確加入1.00mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，50μL程序進(jìn)樣，HPLC-ELSD分析。

2.2.3 系統(tǒng)適用性

取酸棗仁皂苷A 20 μg/mL線性低點(diǎn)溶液，進(jìn)樣分析，評(píng)價(jià)其理論塔板數(shù)為74459,結(jié)果詳見(jiàn)表6。

2.2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制與測(cè)試：分別用微量移液器，移取19.3μL、38.8μL、58.1μL、79.5μL、96.9μL酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1032μg/mL），加入相應(yīng)體積的甲醇，得到1mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，混勻后，進(jìn)樣分析。以面積的對(duì)數(shù)與含量的對(duì)數(shù)擬合直線方程，得Y= 0.6124★X - 0.1448，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9971。

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表1。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

A：方法精密度：按照“2.2.2樣品前處理”進(jìn)行樣品制備，獨(dú)立制備6份，計(jì)算6次獨(dú)立制備樣品的重復(fù)性RSD%。

B: 儀器精密度：取酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μg/mL溶液，進(jìn)樣6次，計(jì)算酸棗仁皂苷A面積的RSD%。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)（準(zhǔn)確度）

樣品制備：樣品制備同“2.3.2樣品前處理”

加標(biāo)樣品制備：稱取1.00克于40mL玻璃瓶中，獨(dú)立稱取9份，分別按照酸棗仁皂苷A理論含量0.027%進(jìn)行約0.5倍、1倍、1.5倍的加標(biāo)，每個(gè)水平三份樣品，然后按照“2.3.2樣品前處理”。具體加標(biāo)濃度及結(jié)果見(jiàn)下表3。

2.2.7 檢出限與定量限試驗(yàn)

取酸棗仁皂苷A低點(diǎn)濃度溶液（20μg/mL），用上述儀器方法進(jìn)行HPLC-ELSD分析，在保留時(shí)間處截取一段基線，以目標(biāo)物峰的響應(yīng)與雜質(zhì)的響應(yīng)求算信噪比（S/N），以此S/N之值線性推算檢出限與定量限。

取酸棗仁皂苷A 20μg/mL濃度溶液，用甲醇進(jìn)行1:1稀釋，得到10μg/mL酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析后，實(shí)際S/N=13.8。取酸棗仁皂苷A 10μg/mL濃度溶液，用甲醇進(jìn)行1:1稀釋，得到5 μg/mL酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析后，實(shí)際S/N=3.7。

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

因此，結(jié)合實(shí)際逐級(jí)稀釋后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)限：酸棗仁皂苷A儀器檢出限為5ug/mL，對(duì)應(yīng)的樣品濃度為50mg/kg（0.005%），酸棗仁皂苷A的定量限為10ug/mL，對(duì)應(yīng)的樣品濃度為100 mg/kg（0.010%）。

2.2.8 專屬性試驗(yàn)

樣品空白制備：稱取1.00克的樣品空白樣，按照“2.2.2樣品前處理”處理樣品，上機(jī)分析，考察是否存在干擾，見(jiàn)典型譜圖1。

樣品制備：稱取1.00克的樣品，按照“2.2.2樣品前處理”處理樣品，上機(jī)分析，考察是否存在干擾及分離度，見(jiàn)典型譜圖2及詳見(jiàn)下表7。

從空白樣品譜圖及實(shí)際樣品譜圖分析，空白樣品在酸棗仁皂苷A處無(wú)干擾，實(shí)際樣品酸棗仁皂苷A的分離度達(dá)到2.2

3 討論

本實(shí)驗(yàn)之所以采用程序進(jìn)樣，是因?yàn)闃悠酚?ml甲醇復(fù)溶后，直接甲醇進(jìn)樣時(shí)，可能是由于進(jìn)樣溶劑強(qiáng)度遠(yuǎn)大于流動(dòng)相起始強(qiáng)度，導(dǎo)致峰型變差，精密度變差。而直接采用50%甲醇水復(fù)溶時(shí)，由于極性較大，雜質(zhì)過(guò)多，專屬性變差。因此采用進(jìn)樣程序，進(jìn)樣環(huán)內(nèi)加入1體積水來(lái)混合，解決了上述問(wèn)題，且重現(xiàn)性和精密度良好。

表1 酸棗仁皂苷A線性試驗(yàn)結(jié)果

表2 酸棗仁皂苷A重復(fù)性

表3 酸棗仁皂苷A回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 酸棗仁皂苷A檢測(cè)限與定量限結(jié)果

譜圖1

譜圖2

結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)方法適用性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、定量限和專屬性考察。采用HPLC-ELSD方法，對(duì)棗仁合劑提取物混合片劑中酸棗仁皂苷A的含量進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，適合于酸棗仁合劑提取物混合片劑中酸棗仁皂苷A的含量的測(cè)定，也可嘗試酸棗仁皂苷A的其他混合提取物的測(cè)試。