柳依江 沈詩彥 杜若桑 張曉輝 邵文娜 崔 ?！?/p>

（1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；2.浙江省杭州市杭州種福堂中醫(yī)醫(yī)院，浙江 杭州 310011）

腦出血是一種嚴(yán)重的，有著高死亡率和不良預(yù)后的卒中類型[1-4]。在我國，相比30年前的同類調(diào)查，腦出血流行狀況十分嚴(yán)峻，其患病率、發(fā)病率大幅上升，為患者及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[5]，其病理過程主要為血液在腦實(shí)質(zhì)中快速蓄積，導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦組織損傷[6]。腦出血致死的患者中，近半數(shù)出現(xiàn)在出血后2 d內(nèi)[7]，其中，血腫源性毒性產(chǎn)物、氧化應(yīng)激反應(yīng)和促炎性反應(yīng)在繼發(fā)性損傷過程中起到重要作用[8-11]。

血紅素加氧酶-1（HO-1）及其代謝產(chǎn)物的活性能對氧化損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等生物過程起關(guān)鍵作用[12-13]。已有研究表明，藥物激活HO-1活性能夠調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制水腫進(jìn)展，減輕早期腦損傷，給予抑制劑組則損傷加重[14]。本實(shí)驗(yàn)以HO-1表達(dá)為關(guān)注點(diǎn)，通過觀察腦出血急性期腦組織中含量變化，探討電項(xiàng)針干預(yù)對腦出血大鼠繼發(fā)性損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只SPF級雄性SD大鼠購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，體質(zhì)量（300±20）g。分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房屏障環(huán)境，光照周期為12 h模擬晝夜交替，溫度為（23±2）℃，自由飲水，SPF級飼料喂養(yǎng)，合格證號：SCXK（京）2016-0011。

1.2 試藥與儀器

鋅原卟啉-9（ZPP-Ⅸ）（美國 Frontier Scientific），qPCR試劑盒（美國KAPA Biosystems），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。桌面數(shù)顯腦立體定位儀（深圳RWD Life Science），華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），分析天平（德國Sartorius），高速冷凍離心機(jī)（Beckman公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國ABI），分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 分組與造模

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組，假手術(shù)組、模型組、電項(xiàng)針組、ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組。實(shí)驗(yàn)采用自體血注入尾狀核形成血腫，制備自體血腦出血模型[15]。操作步驟：使用20%烏拉坦（7 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部備皮，常規(guī)消毒后沿正中線切開約1 cm，確定前囟位置，根據(jù)大鼠腦定位圖譜確定右側(cè)尾狀核位置（前囟右3 mm，后0.2 mm）[16]，使用牙科鉆打孔（d=1 mm），深度至硬腦膜且不傷及腦實(shí)質(zhì)。用1 mL注射器尾靜脈抽取約100 μL，轉(zhuǎn)移到100 μL微量注射器后固定在定位儀上。微量注射器垂直方向緩慢進(jìn)針，深度為5.5 mm，以5 μL/min速度勻速泵入50 μL血液，注射后留針10 min，緩慢退針。骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚并消毒。ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組在造模后30 min腹腔注射ZPP-Ⅸ（質(zhì)量濃度10 mg/mL，劑量10 mg/kg）。假手術(shù)組除不注入自體血外，其余操作同模型組。造模1 d后，使用Longa評分[17]對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評價(jià)，評分大于1分可認(rèn)為造模成功，則納入實(shí)驗(yàn)，否則剔除。數(shù)量不足則根據(jù)隨機(jī)分配補(bǔ)齊并造模。

1.4 干預(yù)方法

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選擇供血（頸4夾脊穴）、風(fēng)池給予電項(xiàng)針干預(yù)[18]。常規(guī)消毒后使用毫針進(jìn)針3 mm，華佗電子針療儀正極接風(fēng)池，負(fù)極接供血。選擇疏波，頻率1 Hz，留針30 min。電項(xiàng)針組和ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組造模后連續(xù)3 d給予干預(yù)，其他組不干預(yù)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 腦組織HO-1 mRNA測定 造模后第3天給予麻醉并斷頭取腦，保存于-80℃。選擇血腫周圍組織，取100 mg使用試劑盒提取樣本總RNA。檢索HO-1核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。引物合成反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行 Real-time PCR 檢測，采用 2（-ΔΔCt）值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。引物序列信息見表1。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 神經(jīng)功能缺損程度評分 使用Longa評分[17]對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評價(jià)。0分：未見任何神經(jīng)損傷癥狀。1分：病灶對側(cè)前肢或后肢不能伸直。2分：行走時(shí)偏向患側(cè)偏轉(zhuǎn)。3分：行走過程向患側(cè)傾倒不能站立。4分：不能行走且有意識障礙。

1.5.3 腦組織含水量測定 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，將用于測量含水量的腦組織用分析天平秤質(zhì)量，得到濕質(zhì)量；置于烘箱內(nèi)用60℃烘干48 h以上，多次稱量至質(zhì)量不再減少，得到干質(zhì)量。腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD分析，方差不齊時(shí)采用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA含量比較

見表2。相較于假手術(shù)組，其他各組HO-1 mRNA表達(dá)均顯著增加，并且電項(xiàng)針組HO-1表達(dá)高于模型組（P＜0.01）。給予抑制劑后，ZPP-Ⅸ模型組、ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組較假手術(shù)組HO-1均有增高，但組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達(dá)比較（2-ΔΔCt，±s）

表2 各組大鼠腦組織HO-1 mRNA的表達(dá)比較（2-ΔΔCt，±s）

與假手術(shù)組比較，?P ＜0.05，??P ＜ 0.01；與模型組比較，△P＜ 0.05，△△P＜0.01。下同

組別HO-1 mRNA n假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組0.578±0.099 1.618±0.328**2.805±0.357**△△1.103±0.220**1.345±0.229**6 6 6 6 6

2.2 各組大鼠腦含水量比較

見表3。造模1 d后大鼠腦含水量增高，在第3日腦含水量增高明顯。相較同時(shí)段假手術(shù)組，各組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。1 d時(shí)電項(xiàng)針組腦組織含水量低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在3 d時(shí)電項(xiàng)針組含水量增高，但仍低于模型組（P＜0.05）。在抑制劑干預(yù)兩組中，兩時(shí)間點(diǎn)ZPP-Ⅸ模型組腦組織含水量均高于ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

表3 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

與ZPP-Ⅸ模型組比較，#P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組3 d 72.96±0.387 81.57±0.815*78.62±0.520*△82.32±0.738*79.78±0.252*#n3 3 3 3 3 1 d 72.85±0.652 78.01±0.510*77.73±0.854*78.49±0.366*78.29±0.291*#

2.3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 見表4。造模后1 d對比假手術(shù)組，各組神經(jīng)功能評分均明顯增高（P＜0.05），第3天神經(jīng)功能評分較第1天有升高。對比ZPP-Ⅸ模型組，ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組神經(jīng)功能評分改善（P＜0.05）。模型組與電項(xiàng)針組比較仍可見神經(jīng)功能損傷改善趨勢（P＞0.05）。

表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

組別假手術(shù)組模型組電項(xiàng)針組ZPP-Ⅸ模型組ZPP-Ⅸ電項(xiàng)針組n6 6 6 6 6 1 d 0.167±0.408 1.667±0.211*1.000±0.408*△2.000±0.258*1.167±0.167*#3 d 0.333±0.516 2.500±0.224 1.667±0.334 2.833±0.167 1.500±0.342#

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為頭為諸陽之會(huì)，六陽經(jīng)交接于頭部，督脈和足太陽經(jīng)直接絡(luò)于腦，其他陽經(jīng)與督脈交會(huì)于大椎穴，故通過刺激頸部穴位，激發(fā)陽氣達(dá)到活血化瘀的目的。實(shí)驗(yàn)中選取的供血（頸4夾脊穴）、風(fēng)池兩穴位于椎動(dòng)脈上方，通過疏波刺激調(diào)節(jié)椎基底動(dòng)脈、Willis環(huán)的血流，進(jìn)而改善出血后腦功能。臨床上，給予電項(xiàng)針干預(yù)能夠通過改善血流供應(yīng)、降低血液黏稠度、減緩急性期腦水腫發(fā)展等來治療腦出血，并對認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)功能損傷癥狀有明顯改善[19-22]。

HO-1是血紅素分解成一氧化碳、鐵和膽綠素過程中的限速酶，可以在血紅素、重金屬、生長因子、細(xì)胞因子等多種刺激物作用下高度上調(diào)。腦出血后，高濃度游離的血紅素能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增高，加速血紅素分解，減少自由基產(chǎn)生，減輕繼發(fā)性損傷。HO-1還可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞防止凋亡，也可以調(diào)節(jié)血管緊張度，使血管松弛，減輕血管壁炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能夠參與血管生成[23-24]。有研究表明腦出血后，紅細(xì)胞溶解釋放血紅素，會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)能量儲備、激活補(bǔ)體系統(tǒng)[25]，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)元死亡[26]。腦出血后高濃度的游離血紅素則促使HO-1表達(dá)升高，使血紅素分解減輕繼發(fā)性損傷。

臨床研究表明，腦出血后3 d內(nèi)HO-1表達(dá)達(dá)到高峰，且與急性期損傷同步[27]，該過程與大鼠腦出血模型研究相一致[28]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫周圍組織HO-1表達(dá)升高同時(shí)，與TNF-α、IL-1β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，能夠發(fā)揮抗炎作用[29]。戴曉紅等研究表明，給予腦出血大鼠頭針干預(yù)能夠上調(diào)病灶周圍HO-1表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化作用，減輕損傷[30]。

本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組對比，各組HO-1表達(dá)均增高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電項(xiàng)針干預(yù)后HO-1表達(dá)較模型組增高。在給予ZPP-Ⅸ抑制劑的兩組中未見差異，說明電項(xiàng)針能夠通過提高HO-1水平來改善出血后損傷。通過腦含水量的測定表明，給予電項(xiàng)針干預(yù)的兩組均能夠抑制腦水腫的發(fā)展，并且作用途徑不僅限于HO-1通路。神經(jīng)功能缺損程度評分，表明電項(xiàng)針干預(yù)能夠改善神經(jīng)功能缺損，電項(xiàng)針與模型組對比雖然差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可見評分降低，需進(jìn)一步研究論證。

綜上，本實(shí)驗(yàn)表明電項(xiàng)針可以提高HO-1表達(dá)，抑制腦水腫進(jìn)展，減輕腦出血后繼發(fā)性損傷，并且能夠改善神經(jīng)功能損傷，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。