李偉，張小英，陳熔，葉嘉宜，苗建銀，陳運(yùn)嬌，曹庸

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州，510642)

冷卻豬肉具有營(yíng)養(yǎng)豐富、切割方便、口感好等特點(diǎn)，是肉類消費(fèi)的主流[1]。冷卻肉又稱冷鮮肉，溫度通常保持0～4 ℃，它的顏色是消費(fèi)者判斷其新鮮程度的重要外觀屬性之一，直接影響消費(fèi)者的購買情況。肉色主要由肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白及高鐵肌紅蛋白3種蛋白的比例和分布決定[2]。冷卻豬肉肉色因肌肉中氧合肌紅蛋白比例大，呈現(xiàn)鮮紅色。冷藏過程中，冷卻肉常受到溫度、光照、pH、氧氣等因素影響，易發(fā)生脂肪氧化，脂肪氧化過程中產(chǎn)生的自由基容易成為促氧化因子，導(dǎo)致肉色改變[3-4]。

抗氧化劑常被用于清除肉中的自由基，起到延緩肉質(zhì)劣變的作用。天然來源的抗氧化劑因安全性高、抗氧化活性強(qiáng)，具有一定保鮮作用，受到人們的青睞[5]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)天然來源活性多酚能有效延緩脂質(zhì)氧化、提高肉色穩(wěn)定性。茶多酚、鼠尾草酚、竹葉黃酮等天然活性多酚對(duì)肉類的保鮮或護(hù)色作用已被大量報(bào)道[6-9]，它們主要通過中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)起作用。桉葉多酚是一種從桉樹葉中提取出來的多酚類物質(zhì)統(tǒng)稱，前期研究[10-11]顯示，它能有效清除多種自由基，具有良好體外抗氧化活性。目前，關(guān)于桉葉多酚的提取工藝優(yōu)化和體內(nèi)外抗氧化活性的研究報(bào)道很多，而在體外肉品護(hù)色方面的研究較少。本試驗(yàn)以冷卻豬肉為研究對(duì)象，探究桉葉多酚對(duì)其護(hù)色的效果研究，以期為桉葉多酚在豬肉中的護(hù)色及抗氧化作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桉葉，采集于廣東省茂名市；新鮮豬里脊肉，廣東省廣州市長(zhǎng)福路卜蜂蓮花超市。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、乙二胺四乙酸鹽(ethylene diamine tetraacetic acid ,EDTA)，天津富宇精細(xì)化工；丙二醛試劑盒，南京建成生物工程研究所；其他分析試劑，廣州市正庚儀器有限責(zé)任公司。

AL104電子天平，梅特勒-托利多；R204B3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì)，上海日島科學(xué)儀器有限公司；CR-400色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；MK-3酶標(biāo)儀， Thermo Labsystems 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桉葉多酚提取與純化

基于前期研究的最佳提取工藝，采用低溫連續(xù)相變萃取裝置制備桉葉多酚[12]。取300 g桉葉粉末(80目)通過低溫連續(xù)相變裝置進(jìn)行提取，泵速為80 L/h，提取2 h，提取溫度為80 ℃，提取壓力為0.5 MPa，將提取物濃縮后再噴霧干燥。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2%乙醇-乙酸乙酯體系萃取3次，提取上清液；再以30%乙醇-乙酸乙酯體系萃取上清液，將萃取后上清液濃縮干燥；最后以福林酚法測(cè)得桉葉多酚總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(526.78±12.46)mg/g。

1.2.2 肉樣處理

市售豬里脊肉置于4 ℃下排酸24 h。在無菌操作臺(tái)內(nèi)剔除豬肉中可見的脂肪和筋膜，將豬肉切成100 g形狀均勻的塊狀，將肉塊放入0、0.4、0.8及1.6 g/L桉葉多酚中浸泡1 min，再將浸泡好的肉塊取出瀝干15 min，用保鮮膜包裹瀝干后的肉塊，置于托盤中于4 ℃條件下保藏。分別于第0、3、6、9及12 天檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)

1.2.3.1 肉色

采用CR-400色差計(jì)測(cè)定豬肉表面肉色L*和a*值。

1.2.3.2 高鐵肌紅蛋白(methemoglobin, MetMb)測(cè)定

參照KRZYWICKI[13]方法，以樣品和緩沖液(0.04 mol/L pH 6.8 磷酸鹽緩沖液)的比例1∶10(g∶mL)提取肉中高鐵肌紅蛋白，12 000 r/min 離心30 min(4 ℃)，吸取上清液分別在525、545、565及572 nm測(cè)定吸光值。MetMb含量按公式(1)計(jì)算：

MetMb/%=

(1)

1.2.3.3 丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定

采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物法測(cè)定丙二醛生成量，參照南京建成生物工程研究所丙二醛試劑盒說明書測(cè)定豬肉的丙二醛值。

1.2.3.4 揮發(fā)性鹽基氮含量

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》方法檢測(cè)冷藏過程中豬肉揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)含量。

1.2.3.5 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》方法測(cè)定豬肉的pH值。

1.2.3.6 汁液流失率

首先稱量包裝豬肉的保鮮袋質(zhì)量m1，再稱量原肉樣和保鮮袋質(zhì)量之和m2，最后稱量保鮮袋和汁液損失總質(zhì)量m3，汁液流失率的按公式(2)計(jì)算[14]：

(2)

1.2.3.7 感官評(píng)價(jià)

參考DJENANE等[15]的方法，感官評(píng)價(jià)小組由6名食品專業(yè)人士組成，感官評(píng)價(jià)前對(duì)小組成員進(jìn)行基本感官評(píng)定訓(xùn)練，為期12 d。采用5分制對(duì)冷卻豬肉進(jìn)行感官評(píng)定，主要包括色澤、氣味和組織狀態(tài)3個(gè)方面(見表1)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用Excel軟件作圖，以SPSS 18.0軟

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation crieeria of pork

件進(jìn)行方差分析，采用Duncan多重比較，顯著水平設(shè)置為P<0.05或P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉肉色的影響

L*值大小反映肉色明暗度，L*值越大，肉色亮度越高，反之則肉色偏暗。由表2可知，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組L*值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，對(duì)照組和桉葉多酚組間無顯著差異(P>0.05)。L*值在冷藏初期(第0～6天)逐漸升高，這可能因?yàn)樨i肉內(nèi)部水分滲出，光線反射多，造成亮度提高，肉色趨于變白。隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，在第6～12天，肉色L*值呈下降趨勢(shì)，豬肉因?yàn)榧?xì)菌滋生、氧化酸敗等原因，肉色逐漸變暗。桉葉多酚組仍然略高于對(duì)照組，說明其具有一定維持肉色亮度的作用。

表2 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉肉色L*值的影響Table 2 Changes in L* value of chilled pork duringstorage treated by EPE

注：不同字母代表同一貯藏期不同處理的差異顯著性(P<0.05)(下同)

a*值與豬肉中肌紅蛋白含量及肌紅蛋白氧化還原形式密切相關(guān)，豬肉肌紅蛋白含量高、氧合肌紅蛋白比例大、高鐵肌紅蛋白比例低，肉色的a*值就大，反之則小[17-18]。如表3所示，各組肉色a*值總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(P<0.05)。冷藏前3 d，對(duì)照組和桉葉多酚各組a*值趨于平穩(wěn)或呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)(P>0.05)，這是因?yàn)樨i肉內(nèi)源性抗氧化酶等物質(zhì)起到一定的抗氧化作用。豬肉中的肌紅蛋白與空氣中的氧氣結(jié)合生成氧合肌紅蛋白，這個(gè)時(shí)期以氧合肌紅蛋白為主要形式，因此肉色a*值高，肉色呈鮮紅色[19]。第6～12天，桉葉多酚各組肉色a*值逐漸下降但顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系。同一貯藏期內(nèi)高劑量桉葉多酚組a*值最高，這說明桉葉多酚具有顯著的抗氧化效果，能減少脂質(zhì)一級(jí)或者二級(jí)氧化物形成，延緩氧合肌紅蛋白向褐色的高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)變，維持肉色穩(wěn)定。相似研究[14]指出，生育酚制成的抗氧化膜在冷卻豬肉保鮮中也會(huì)通過抗氧化作用減緩脂質(zhì)氧化，以達(dá)到維持豬肉色澤的效果。

表3 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉肉色a*值的影響Table 3 Changes in a* value of chilled pork duringstorage treated by EPE

2.2 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉MetMb的影響

由圖1可得，各組豬肉的MetMb含量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增高趨勢(shì)(P<0.05)，相同貯藏期桉葉多酚組MetMb含量均低于對(duì)照組。

圖1 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉高鐵肌紅蛋白的影響Fig.1 Changes in methemyoglobin content of chilled porkduring storage treated by EPE

有研究表明隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，肉中抗氧化物類物質(zhì)不斷消耗，MetMb含量增長(zhǎng)速度逐漸加快；采用浸泡、噴淋抗氧化劑的方式可以有效延緩脂質(zhì)氧化，降低MetMb含量[20]。第0～3天內(nèi)，各組MetMb含量無顯著變化(P>0.05)。第6～12天，0.4 g/L桉葉多酚組MetMb含量與對(duì)照組無顯著變化(P>0.05)，而0.8和1.6 g/L桉葉多酚組均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。此外，0.8 g/L桉葉多酚組MetMb含量在9～12 d時(shí)顯著高于1.6 g/L桉葉多酚組。綜上，在整個(gè)貯藏周期內(nèi)，桉葉多酚組豬肉MetMb含量低于對(duì)照組，說明了桉葉多酚有抗氧化作用并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。貯藏后期(9～12 d)，低中濃度桉葉多酚組中豬肉表面抗氧化物質(zhì)有效濃度因消耗而逐漸降低，MetMb含量上升速度加快；高濃度桉葉多酚組抗氧化效果顯著，MetMb含量顯著低于對(duì)照組和低中濃度桉葉多酚組(P<0.01)。此結(jié)果與桉葉多酚組肉色a*值變化相一致，MetMb含量越低，a*值越大，兩者呈負(fù)相關(guān)，說明桉葉多酚具有抗氧化作用，延緩MetMb生成。

2.3 桉葉多酚對(duì)冷卻肉MDA值的影響

豬肉在儲(chǔ)藏過程中會(huì)逐步發(fā)生脂肪氧化，產(chǎn)生大量自由基，這些自由基會(huì)引起褐變作用，造成肉色變暗等生理變化[21-22]。由圖2可知，貯藏期內(nèi)豬肉中MDA值逐漸增高(P<0.05)，且桉葉多酚各組均低于對(duì)照組。第6天時(shí)，1.6 g/L桉葉多酚組MDA值顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；對(duì)照組和低中濃度桉葉多酚組無顯著變化(P>0.05)。此時(shí)高濃度桉葉多酚組體現(xiàn)出良好的抗氧化效果，能有效延緩豬肉貯藏過程中的氧化作用，降低肉中MDA值。第9天時(shí)，中高濃度桉葉多酚組均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，低濃度桉葉多酚組與對(duì)照組無顯著變化(P>0.05)。由圖2可以看出，低濃度桉葉多酚組抗氧化效果在此時(shí)逐漸下降，推測(cè)多酚類物質(zhì)有效濃度降低，肉中MDA值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而中高濃度桉葉多酚持續(xù)具有良好抗氧化效果[21-22]。第12天時(shí)，1.6 g/L桉葉多酚組MDA值極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，呈現(xiàn)良好的抗氧化作用。但由圖2可以看出，桉葉多酚各組MDA值增長(zhǎng)速率均突然變大，說明豬肉表面桉葉多酚中有效抗氧化成分逐漸消耗，抗氧化能力開始下降。

圖2 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉MDA的影響Fig.2 Changes in MDA of chilled pork during storagetreated by EPE

2.4 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉TVB-N含量的影響

TVB-N是肉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，肉中蛋白質(zhì)由微生物及相關(guān)酶分解成氨或胺類等堿性物質(zhì)，導(dǎo)致TVB-N含量升高從而使肉品變質(zhì)[17]。根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：TVB-N值低于150 mg/kg，為一級(jí)鮮度肉；TVB-N值為150～200 mg/kg，為二級(jí)鮮度肉；TVB-N值大于200 mg/kg，為變質(zhì)肉[23-24]。結(jié)果表明(圖3)，對(duì)照組及桉葉多酚組肉中TVB-N含量隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而增大。對(duì)照組在第6天TVB-N含量為151.2 mg/kg，表明豬肉處于二級(jí)鮮度肉；此時(shí)中高劑量桉葉多酚組TVB-N含量為134.9和129.4 mg/kg(P<0.05)。第9天時(shí)，低中桉葉多酚劑量組TVB-N含量均高于肉品限定值150 mg/kg，而1.6 g/L桉葉多酚組[(144.8±21.9)mg/kg]顯著低于對(duì)照組[(212.0±17.7)mg/kg]。第12天時(shí)，各組TVB-N含量均超過正常值，豬肉屬于變質(zhì)肉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高濃度桉葉多酚更能顯著降低肉中TVB-N含量，起到延緩豬肉變質(zhì)的作用。茶多酚、燕麥多酚、蘋果多酚等在豬肉保鮮實(shí)驗(yàn)中均能降低冷卻豬肉冷藏過程中TVB-N含量，延緩因微生物引起的過度脫氨及脫羧等作用，提高豬肉貨架期[5-6,16]。桉葉多酚顯著降低冷藏過程中豬肉TVB-N含量，推測(cè)其同樣通過抑制微生物生長(zhǎng)從而起到延緩豬肉貨架期的作用。

圖3 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉TVB-N含量的影響Fig.3 Changes in TVB-N content of chilled pork duringstorage treated by EPE

2.5 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉pH值的影響

pH值是評(píng)價(jià)肉質(zhì)的重要指標(biāo)，隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，肉中蛋白質(zhì)由微生物及相關(guān)蛋白酶的作用逐漸分解成氨類和堿性類物質(zhì)，導(dǎo)致肉的堿度提高。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9695.5—2008，一級(jí)鮮度肉pH為5.8～6.2、二級(jí)鮮度肉pH為6.3～6.6和變質(zhì)肉pH>6.7[5, 14]。如圖4所示，對(duì)照組和桉葉多酚組pH值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。第6天時(shí)，對(duì)照組[pH(6.23±0.04)]已經(jīng)處于二級(jí)鮮度肉，而中高劑量桉葉多酚組豬肉pH<6.2，仍屬于一級(jí)鮮度肉。第9天時(shí)，中高劑量桉葉多酚組pH值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，屬于二級(jí)鮮度肉。第12天時(shí)，低中劑量桉葉多酚組pH值與對(duì)照組無顯著差別(P>0.05)，屬于變質(zhì)肉；高劑量桉葉多酚組pH值[pH(6.67±0.08)]低于對(duì)照組(P<0.05)。這說明桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉具有一定保鮮作用，多酚添加量濃度越高，保鮮效果越好。

圖4 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉pH值的影響Fig.4 Changes in pH value of chilled pork during storagetreated by EPE

2.6 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉汁液流失率的影響

豬肉在冷藏過程中隨著細(xì)菌大量繁殖，肌肉的組織狀態(tài)會(huì)逐漸破壞，持水性逐漸變差，組織間汁液流失[25]。由圖5可知，隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和桉葉多酚組汁液流失率逐漸增大；第6～12天時(shí)，中高劑量桉葉多酚組汁液損失率顯著低于對(duì)照組，其中，第12天時(shí)，1.6 g/L桉葉多酚組汁液損失率最低，顯著低于對(duì)照組18.25%(P<0.05)。尹愛武等[24]研究指出刺兒茶多酚能有效降低冷卻豬肉儲(chǔ)藏過程中汁液損失率。推測(cè)桉葉多酚的抗氧化作用可延緩細(xì)胞膜膜脂氧化，從而降低豬肉汁液損失[26-27]。楊文平等[28]的研究表明,植物多酚與冷卻豬肉蛋白質(zhì)以疏水鍵或氫鍵相結(jié)合，豬肉表面因收斂作用從而減少汁液損失，提高冷卻豬肉的保水性。

圖5 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉汁液流失率的影響Fig.5 Changes in dripping loss of chilled pork during storagetreated by EPE

2.7 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉感官評(píng)價(jià)的影響

由圖6-a可知，豬肉貯藏期間肉色呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。前3 d，試驗(yàn)各組色澤感官評(píng)分均在4分左右，肌肉色澤無明顯變化(P>0.05)。第3～12天，同一貯藏期內(nèi)桉葉多酚各組色澤感官評(píng)分均高于對(duì)照組，尤其1.6 g/L桉葉多酚組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。感官評(píng)價(jià)的得分情況反映出桉葉多酚延緩肉色氧化的效果，這與前文中a*值和MetMb含量的變化相一致。

圖6 桉葉多酚對(duì)冷卻豬肉感官評(píng)價(jià)中色澤、氣味及組織狀態(tài)的影響Fig.6 Result on color, ordourand texture evaluation of chilled pork treated with EPE of different concentration

由圖6-b可知，感官評(píng)價(jià)中氣味指標(biāo)在豬肉貯藏過程中下降顯著(P<0.05)。貯藏期間，桉葉多酚組氣味得分均高于對(duì)照組。但實(shí)驗(yàn)各組在第12天時(shí)，豬肉有明顯氨味出現(xiàn)，此時(shí)對(duì)照組評(píng)分為0.78，低中高桉葉多酚組得分分別為1.6、2.15和2.45。這說明豬肉在存儲(chǔ)期間因?yàn)橹狙趸臀⑸镒躺葐栴}，產(chǎn)生了揮發(fā)性鹽基氮及氨類等臭味物質(zhì)，造成氣味評(píng)分顯著降低[29]。豬肉在冷藏過程中不可避免會(huì)受到外界因素影響而發(fā)生氧化變質(zhì)，但從圖6-b可知，桉葉多酚仍有一定延緩脂肪氧化的作用。

由圖6-c可知，冷藏期間豬肉組織狀態(tài)與色澤、氣味變化一致，評(píng)分呈下降趨勢(shì)。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，豬肉中微生物增加，蛋白質(zhì)被分解，同時(shí)細(xì)胞因細(xì)胞膜氧化、破碎造成失水嚴(yán)重，豬肉組織彈性明顯下降，豬肉表面黏度也逐漸增大。高濃度桉葉多酚組在第9、12天時(shí)雖然肉的彈性和黏度有所下降，但組織狀態(tài)得分顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

桉葉多酚作為一種天然來源提取物，含有黃酮類、?；g苯三酚衍生物、萜類及其苷類等活性物質(zhì)，此外還有一些高活性的不穩(wěn)定物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、改善動(dòng)物肌肉肉色等作用[11, 30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，桉葉多酚能有效降低冷藏過程中豬肉TBARS含量、TVB-N含量、pH值及汁液損失率，延緩豬肉脂質(zhì)氧化。豬肉中因脂質(zhì)氧化產(chǎn)生過剩的自由基被桉葉多酚部分清除，能降低細(xì)胞中高鐵肌紅蛋白含量，從而提高豬肉的a*值，起到改善豬肉肉色的作用。桉葉多酚組豬肉色澤、氣味及組織狀態(tài)感官評(píng)價(jià)評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組。同屬天然活性多酚的茶多酚，同樣因其優(yōu)良的抗氧化活性在肉制品、水果等保鮮方面均有應(yīng)用，可有效改善肉色、降低TVB-N含量及pH值等指標(biāo)[2，20]，這與多酚能終止自由基連鎖反應(yīng)，起到有效抗氧化和清除自由基能力有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上，桉葉多酚能顯著改善冷卻豬肉保鮮效果，延長(zhǎng)豬肉貨架期。本研究首次為桉葉多酚在冷卻豬肉保鮮方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，后續(xù)仍需深入研究桉葉多酚維持肉色及其抗氧化作用的潛在機(jī)理。桉葉多酚作為一種新型天然活性多酚，具有深遠(yuǎn)的研究及應(yīng)用價(jià)值。