趙雪平，溫雅嬌，李正英*，鄭海武，黃海英，李曉娟

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭，014109) 2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

酵母菌在葡萄酒發(fā)酵過程中扮演著重要的角色，它可以分解葡萄汁中的大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2。但還會(huì)生成一些其他的代謝產(chǎn)物，包括甘油、高級醇、酯、醛等，而這些代謝產(chǎn)物影響了葡萄酒的色澤、香氣及口感， 決定著葡萄酒的質(zhì)量[1]。釀酒酵母的篩選是優(yōu)良酵母菌選育的基礎(chǔ)，因此意義非常巨大。酵母的一般來源有果實(shí)表面、土壤、發(fā)酵醪液等，內(nèi)蒙古烏海地區(qū)的地理和氣候?yàn)槠咸焉L提供了很好的條件，優(yōu)質(zhì)的葡萄又為酵母菌提供了生長繁殖的場所，因此期許在此地區(qū)能夠篩選出優(yōu)良的釀酒酵母菌。另外優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)具備起酵快的特點(diǎn)，而且也要有一定的耐受性，也是考察釀酒酵母能否運(yùn)用于生產(chǎn)的條件[2]。目前大多數(shù)釀酒企業(yè)或酒莊都使用進(jìn)口釀酒酵母或國內(nèi)的安琪酵母，國內(nèi)釀酒酵母品種單一，這也是篩選釀酒酵母的另一個(gè)重要原因[3]。

本研究篩選內(nèi)蒙古烏海地區(qū)的葡萄果皮、果園土樣以及自然發(fā)酵醪液中的釀酒酵母，并以商品化釀酒酵母為對照，研究其耐受性、發(fā)酵特性并進(jìn)行了鑒定，以期為我國葡萄酒品質(zhì)提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

(1)測試菌種：采集于內(nèi)蒙古烏海地區(qū)釀酒葡萄果園的土壤、果實(shí)表皮及發(fā)酵醪液。

(2)對照菌種：商用釀酒酵母CECA(安琪酵母股份有限公司)、商用釀酒酵母CSM(法國拉曼公司)。

1.1.2 原料

釀酒葡萄采于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：孟加拉紅0.033，氯霉素0.1，MgSO40.5，KH2PO41，蛋白胨5，葡萄糖10，瓊脂15；

YEPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉5，蛋白胨10，瓊脂14，葡萄糖20；

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；

TTC上層培養(yǎng)基[4](g/L)：氯化三苯基四氮唑(TTC) 0.5，葡萄糖5，瓊脂15；

TTC下層培養(yǎng)基[4](g/L)：MgSO40.4，KH2PO41.0，酵母浸出粉1.5，蛋白胨2，葡萄糖10，瓊脂20，調(diào)節(jié)pH至5.5；

BIGGY瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：BIGGY瓊脂45；

產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基[5-6](g/L)：溴甲酚紫0.04，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO41，MgSO41，KH2PO41，酵母浸粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖200。

1.1.4 主要試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；瓊酯粉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；(NH4)2SO4，天津市天大化學(xué)試劑廠；MgSO4，北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠；NaOH，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；乳酸，天津市化學(xué)試劑三廠；乳酸鉀，山東優(yōu)索化工科技有限公司；酒石酸鉀鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母菌DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；引物、dNTPs、Taq 酶，上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.5 儀器與設(shè)備

synergyHIMF+Take3全功能酶標(biāo)儀，美國BioTek儀器有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱、LRH-70生化培養(yǎng)箱、CX21光學(xué)顯微鏡、HWS12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-700立式壓力蒸汽滅菌鍋，北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；VD-1320超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HC-2518R高速離心機(jī)，海玉博生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母菌株的分離純化

采集內(nèi)蒙古烏海地區(qū)的果園土壤30份、葡萄表皮30份和農(nóng)家發(fā)酵醪液10份，作為酵母菌的分離來源。將收集的葡萄或土壤樣品制成菌液，并且稀釋，吸取50 μL稀釋后的菌液于孟加拉紅固體平板上，用涂布棒涂勻，28 ℃培養(yǎng)1～3 d。挑選單個(gè)的具有典型酵母菌菌落特征且形態(tài)差異較為明顯的菌落，劃線純化2～3代，將上述分離純化得到的酵母菌接入YEPD斜面培養(yǎng)基，4 ℃保藏。

1.2.2 釀酒酵母菌株的篩選

將分離后的酵母菌株利用TTC培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)乙醇能力，BIGGY瓊脂培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)H2S的性能以及產(chǎn)酯培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)酯特性。篩選出產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)、低產(chǎn)H2S且高產(chǎn)酯的優(yōu)良酵母菌株。

1.2.2.1 高產(chǎn)乙醇酵母菌株的篩選

酵母菌株劃線接種到TTC下層培養(yǎng)基上，以商業(yè)釀酒酵母CECA和CSM及空白試驗(yàn)作為對照，28 ℃培養(yǎng)1～3 d后，在菌落上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，28 ℃遮光培養(yǎng)。觀察各平皿中菌落的顯色情況，菌株與培養(yǎng)基反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)白色、淺紅色、紅色和深紅色，菌落呈現(xiàn)的顏色越深，表明菌株產(chǎn)乙醇能力越強(qiáng)。

1.2.2.2 低產(chǎn)H2S酵母菌株的篩選

將1.2.2.1中篩選出的高產(chǎn)乙醇酵母菌株點(diǎn)種到BIGGY瓊脂培養(yǎng)基上，并以商業(yè)釀酒酵母CECA和CSM及空白試驗(yàn)作為對照，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，觀察各菌株菌落顏色，菌株產(chǎn)生的H2S與BIGGY培養(yǎng)基中的鉍發(fā)生反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)白色、黃色、淺棕色和深棕色，顏色越深，代表菌株產(chǎn)H2S的量越多。

1.2.2.3 高產(chǎn)酯酵母菌株的篩選

將1.2.2.2中篩選出的酵母菌株劃線接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，以商業(yè)釀酒酵母CECA和CSM及空白試驗(yàn)作為對照。觀察其菌落顏色。菌株產(chǎn)酯能力不同所呈現(xiàn)在產(chǎn)酯平板上的菌落顏色也不相同，菌落黃色越深，表明菌株的產(chǎn)酯量越多[7]。

1.2.3 酵母菌株耐受性測定

耐受性測定包括耐乙醇性能試驗(yàn)、耐SO2性能試驗(yàn)、高糖耐受性試驗(yàn)和低pH的耐受性試驗(yàn)，將YPD液體培養(yǎng)基分裝到試管中再放入倒置的杜氏管中，杜氏管內(nèi)不含空氣。121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫，按照表1的條件調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度梯度，接種待測酵母菌株體積分?jǐn)?shù)為2%，每個(gè)處理平行3次，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，觀察其產(chǎn)氣狀況判斷其耐受性。以商業(yè)釀酒酵母CECA和CSM及空白試驗(yàn)作為對照。

表1 酵母菌株耐受性測定條件梯度Table 1 Conditional gradient for tolerance measurement ofyeast strains

1.2.4 優(yōu)良菌株的鑒定

1.2.4.1 酵母菌DNA的提取

采用柱式酵母基因組 DNA 抽提試劑盒提取。

1.2.4.2 菌株26S rDNA D1/D2基因序列的PCR擴(kuò)增

(1)引物設(shè)計(jì)：正向引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和反向引物NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)[8-10]。

(2)反應(yīng)體系：引物(10 μmol/L)各0.5 μL，基因組 DNA 0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。

(3)PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，4 min；94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min，循環(huán)30次；72 ℃，延伸10 min。PCR產(chǎn)物取5 μL在1%瓊酯糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳檢測，電泳參數(shù)：150 V，100 mA，10～20 min電泳觀察[8-10]。

酵母菌株序列測定后，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，通過比對測序菌株與數(shù)據(jù)庫中模式菌株的可信值，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)品感官評價(jià)

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的優(yōu)良菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在 10 ℃、12 000 r/min條件下離心3 min，收集菌泥備用[11]。選用種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)的葡萄進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)[葡萄汁理化指標(biāo)為: 23.0 °Brix，還原糖154.07 g/L，總酸(6.86±0.2)g/L，pH 3.14]。葡萄汁中按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入優(yōu)良酵母菌株，同時(shí)用法國商業(yè)酵母CSM和國產(chǎn)商業(yè)酵母CECA作對照。在 25 ℃下恒溫發(fā)酵。每24 h測定還原糖、總酸和乙醇體積分?jǐn)?shù)，當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下降至4 g/L 以下時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束，按照GB/T 15037—2006[12]的方法，組織7位有經(jīng)驗(yàn)的品評員，進(jìn)行感官評定[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離純化

將釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的部分地區(qū)所采集的葡萄及其果園土壤樣品或發(fā)酵醪液中酵母菌的分離純化，通過對酵母菌形態(tài)觀察以及顯微鏡鏡檢，初步去除重復(fù)菌株，共篩選出13株酵母菌株編號為KY1～KY3、KA1～KA3、KX1～KX4、KB1～KB3，如圖1所示，多數(shù)為出芽繁殖的橢球形菌株。

圖1 酵母菌在YEPD培養(yǎng)基上的菌落特征以及顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 Colony characteristics of yeast on YEPD medium andmorphology under microscope

2.2 酵母菌株篩選

2.2.1 高產(chǎn)乙醇酵母菌的篩選

將分離純化的13株酵母菌進(jìn)行產(chǎn)乙醇能力試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 酵母菌在TTC培養(yǎng)基上的顯色結(jié)果Table 2 Chromogenic results of yeast on TTC medium

由表2可知，有4株酵母菌(KX4、KA3、KX2、KX3)的菌落在TTC培養(yǎng)基上呈深紅色，其產(chǎn)乙醇能力與對照組相當(dāng)，因此選擇這4株產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的酵母菌進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。

圖2 酵母菌在TTC培養(yǎng)基上的的顯色結(jié)果Fig.2 The colour results of yeast on TTC medium注：從左到右為：深紅色、紅色、淺紅色

2.2.2 低產(chǎn)H2S酵母菌株的篩選試驗(yàn)

將高產(chǎn)酒精的4株酵母菌進(jìn)行低產(chǎn)H2S酵母菌株的篩選試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 酵母菌在BIGGY培養(yǎng)基上菌落顏色Table 3 Colony colour of yeast on BIGGY medium

BIGGY瓊脂是一種具有選擇性的培養(yǎng)基，使用鉍作為指示劑，來測定菌株生長時(shí)是否有產(chǎn)生H2S[14]，顏色越深，表面菌株產(chǎn)H2S越多[15]。由圖3可知，對照菌株CECA菌落在BIGGY培養(yǎng)基上呈淺棕褐色，為低產(chǎn)H2S酵母，CSM呈棕褐色，為中產(chǎn)H2S酵母。H2S產(chǎn)生的不良?xì)馕稌?huì)影響葡萄酒的風(fēng)味[16]，且對人體有毒害作用，基于此，僅保留低產(chǎn)和中產(chǎn)H2S的菌株KX3、KX2和KX4作后續(xù)研究。

圖3 酵母菌在BIGGY培養(yǎng)基上的的顯色結(jié)果Fig.3 The results of yeast colour on BIGGY medium注：從左到右為：淺棕褐色、棕褐色、褐色

2.2.3 高產(chǎn)酯酵母菌株的篩選結(jié)果

將3株低產(chǎn)或中產(chǎn)H2S高產(chǎn)乙醇酵母分別接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，并以商業(yè)菌株CECA和CSM作對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～3 d。觀察菌落附近的顏色并記錄，顯色結(jié)果見表4。

表4 產(chǎn)酯特性篩選結(jié)果Table 4 Screening results of ester-producing characteristics

由圖4可知，對照菌株CECA、CSM及KX3的菌落在產(chǎn)酯培養(yǎng)基上呈深黃色，即產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，所以選擇KX3酵母菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 酵母菌在產(chǎn)脂培養(yǎng)基上的的顯色結(jié)果Fig.4 The colour results of yeast on lipid-producing medium注：從左到右為：黃色、淺黃色

2.3 釀酒酵母菌株的鑒定

2.3.1 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增

如圖5所示，通過對酵母菌株DNA 的提取和PCR擴(kuò)增，可以看出酵母菌株的DNA片段長度在580～600 bp左右，符合前人對酵母菌基因序列長度的研究范圍[17]。

圖5 酵母菌株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖Fig.5 PCR amplified electrophoresis map of yeast strains

2.3.2 酵母菌株26S rDNAD1/D2區(qū)測序結(jié)果

DNA測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對，結(jié)果如表5所示。比較得到酵母菌株KX3的DNA片段與釀酒酵母同源性最高，達(dá)到100%，與測序結(jié)果進(jìn)行對比，并用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖6所示。最終確定酵母菌株KX3為釀酒酵母。

表5 酵母菌株26S rDNA D1/D2序列測序結(jié)果Table 5 Sequencing results of 26S rDNA D1/D2 sequenceof yeast strain

圖6 酵母菌株26S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed by yeast strain 26S rDNA

2.4 釀酒酵母耐受能力測定

將篩選出的酵母菌株KX3進(jìn)行耐受性試驗(yàn)測定，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 酵母菌株耐受性能測定試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Screening results of ester-producing characteristics

由表6可知，菌株KX3的耐乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%，耐SO2質(zhì)量濃度為400 mg/L耐高糖質(zhì)量濃度為500 g/L，耐低pH值為2.5，符合釀酒生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 酵母菌發(fā)酵特性研究

由圖7可知，斜率越大發(fā)酵越快，KX3與CECA的發(fā)酵速率相當(dāng)，且高于菌株CSM；從圖8可以看出，從第4～12 h起，OD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長而快速增長，進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)到12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，說明該菌株具有良好的生長特性[18-19]。

圖7 CO2失重量Fig.7 CO2 weight loss

圖8 KX3生長曲線圖Fig.8 OD600 value of growth curve of KX3

2.6 酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)品感官評價(jià)

對優(yōu)選的釀酒酵母KX3和2株商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性等方面進(jìn)行了評分[20-21]，結(jié)果見圖9。

圖9 不同酵母菌發(fā)酵的干紅葡萄酒感官評定Fig.9 Sensory scoring scale for dry red wine fermentedby different yeasts

在2株商業(yè)酵母菌和1株優(yōu)選酵母菌發(fā)酵葡萄酒的感官評分中，CECA發(fā)酵葡萄酒經(jīng)感官評價(jià)，酒體澄清透亮有光澤，呈寶石紅色，有典型的葡萄酒風(fēng)味，回味綿長，總評分為91分；CSM發(fā)酵葡萄酒經(jīng)感官評價(jià)，酒體澄清透亮有光澤，呈寶石紅色，清新爽口，果香協(xié)調(diào)，具有典型性，總評分為85分；KX3發(fā)酵葡萄酒，酒體澄清透亮有光澤，呈寶石紅色，口感細(xì)膩柔和，果香馥郁，酒體豐滿，典型明確，總評分為89分。篩選出的優(yōu)良菌株中KX3釀制的葡萄酒評分僅次于對照菌CECA ,具備葡萄酒的典型特性。

3 結(jié)論

優(yōu)良釀酒酵母菌表現(xiàn)為具有良好的耐受性、發(fā)酵特性及發(fā)酵產(chǎn)品典型的風(fēng)味，目前本土優(yōu)良釀酒酵母菌有待進(jìn)一步的分離和篩選，本文以內(nèi)蒙古烏海地區(qū)果園的土壤、葡萄果皮及發(fā)酵醪液為篩選源，并以商業(yè)釀酒酵母菌CECA、CSM為對照，篩選出的菌株KX3經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)測序鑒定為釀酒酵母菌，耐乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%，耐SO2質(zhì)量濃度為400 mg/L，耐高糖質(zhì)量濃度為500 g/L，耐pH值為2.5，并且起酵快，經(jīng)感官評定，酒體果香濃郁、典型性好，可以運(yùn)用于商業(yè)化生產(chǎn)，而發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。