王如月,余訊,徐靜靜,朱莉,詹曉北*,張洪濤
1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院,江蘇 無錫,214002) 3(無錫格萊克斯生物科技有限公司,江蘇 無錫,214125)
人類腸道中有數(shù)萬億個微生物,已發(fā)現(xiàn)有超過1 500個不同的種類[1],這些腸道微生物群構(gòu)成了一個復(fù)雜的群體,它們對于宿主的免疫和代謝至關(guān)重要,與人類的健康和疾病息息相關(guān)[2-3]。膳食是影響人體腸道菌群微生態(tài)最重要的因素之一,腸道微生物本身及其代謝產(chǎn)物不僅能夠調(diào)節(jié)人體代謝,更能在膳食和宿主之間起到重要的橋梁作用[4-5]。ZHAO等[6]發(fā)現(xiàn),膳食纖維可以選擇性地促進腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)菌的生長,從而增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量,進而減輕2型糖尿病的癥狀。MIYAMOTO等[7]通過將無菌小鼠與普通小鼠進行對比實驗,發(fā)現(xiàn)大麥β -葡聚糖的有益代謝作用,是通過腸道微生物群產(chǎn)生的SCFAs促進腸激素分泌誘導(dǎo)而起作用的。
燕麥是一種全價營養(yǎng)谷物,近年來,隨著人們對健康的關(guān)注,燕麥因其高膳食纖維含量成為研究熱點。β -葡聚糖天然存在于燕麥的細胞壁中,被認為是具有潛在益生元特性的功能物質(zhì)[8]。燕麥β -葡聚糖作為常見的膳食纖維具有降低膽固醇和餐后血糖反應(yīng)等功效,這在針對動物[9]以及人類[10]的許多研究中都得到了證實。β-葡聚糖的水解產(chǎn)物β-葡寡糖,作為一種不可消化的低聚糖,也被證實具有促進乳酸菌生長[11]和免疫調(diào)節(jié)[12]等的作用。
燕麥β-葡聚糖(oat β-glucans, OGs)及其寡糖(oat β-glucans oligosaccharides, OGOs)不可以被人體自身消化吸收,但可以進入結(jié)腸被腸道菌群利用,能夠作為益生元影響腸道微生物的組成以及其代謝產(chǎn)物的變化。近年來,國內(nèi)外對β-葡聚糖益生功能的研究日趨增多,SHEN等[13]報道了燕麥β-葡聚糖可以促進小鼠腸道菌群雙歧桿菌和乳酸菌生長,并減少大腸桿菌數(shù)量。LAM等[8]對不同分子質(zhì)量的β-葡聚糖進行了益生元效果評價,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為28 000 Da的β-葡聚糖的益生元效果最佳。但是目前國內(nèi)外對低聚糖類益生元的研究主要集中在低聚果糖、低聚半乳糖等,關(guān)于植物來源的β-葡寡糖對腸道菌群改善作用的研究較少,有關(guān)腸道菌群對β-葡聚糖和其水解產(chǎn)物β-葡寡糖的發(fā)酵特性差異的研究更是鮮有報道。
本研究通過以O(shè)Gs及其水解產(chǎn)物OGOs為碳源,對健康人和2型糖尿病人來源的糞便菌群進行體外厭氧發(fā)酵,研究OGs和OGOs對不同來源腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝物的影響,初步探索腸道菌群對OGs及其水解產(chǎn)物OGOs的發(fā)酵特性差異。
1.1.1 主要實驗材料
燕麥(AvenasativaL.)麩皮,河北省張家口市萬全縣;菊粉,比利時cosucra公司;耐高溫α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、刃天青,麥克林生化科技有限公司;維生素K1、L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽汁鹽,Sigma-Aldrich公司;TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司;熒光定量試劑Fast SYBR Green Master Mix,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;其他試劑,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
1.1.2 主要儀器與設(shè)備
多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)(DAWN HELEOS Ⅱ),美國懷雅特技術(shù)公司;MALDI-TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀,美國布魯克·道爾頓公司;厭氧培養(yǎng)箱(HYQX-Ⅱ),上海躍進醫(yī)療器械有限公司;氣相色譜儀(7890A),安捷倫科技有限公司;StepOnePlus實時熒光定量PCR儀,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
1.2.1 OGs的提取純化方法
β-葡聚糖提取采用熱水浸提法,參考PAPAGEORGIOU等[14]的方法,略有改動。提取流程見圖1。利用MCCLEAR等[15]的方法測定β-葡聚糖的純度,不同批次制得的OGs純度范圍在85.7%~93%。
圖1 OGs的提取流程圖Fig.1 The extraction flow chart of OGs
1.2.2 OGOs的制備方法
OGOs由OGs酸解制得,準備10 g/L的OGs溶液,80 ℃水浴預(yù)熱,加入等體積的H2SO4溶液(2 mol/L)。在80 ℃水浴振蕩下酸解3.5 h,使用Ba(OH)2中和樣品,過濾除去BaSO4沉淀,并用去離子水洗滌沉淀。將水解液體積濃縮至1/5,用3倍體積乙醇醇沉除去大分子多糖,10倍體積乙醇醇沉,將寡糖醇沉下來,取沉淀,復(fù)溶于水,透析48 h除鹽(透析袋截留分子質(zhì)量為100~500 Da),冷凍干燥得OGOs。
1.2.3 OGs和OGOs的分子質(zhì)量測定
OGs的分子質(zhì)量測定采用凝膠滲透色譜和十八角度激光散射聯(lián)用技術(shù)測定,采用分子篩柱SHODEX SB-804-HQ,柱溫30 ℃,流動相100 mmol/L NaNO3,流速0.5 mL/min。利用基質(zhì)輔助激光電離飛行時間質(zhì)譜分析OGOs的聚合度分布,質(zhì)譜掃描范圍(m/z)100~3 000。
1.3.1 糞便樣品的收集
新鮮的糞便樣品取自無錫市當?shù)蒯t(yī)院和大學(xué),共5位2型糖尿病患者和5位健康志愿者,其中5位健康志愿者,3男2女,年齡47~63歲,身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為(26.60±1.64) kg/m2,空腹血糖為(4.92±1.02) mmol/L。5位2型糖尿病患者,4男1女,年齡45~64歲,BMI為(24.82±1.87) kg/m2,空腹血糖為(8.97±2.15) mmol/L。所有的志愿者均遵循正常中國飲食,沒有消化系統(tǒng)疾病,且至少3個月沒有服用抗生素。糞便樣品用專用的糞便收集盒收集后,低溫保存運輸。將收集到的新鮮糞便樣品,分為健康組和2型糖尿病組,每組糞便樣品等質(zhì)量混合后,用無菌PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)按照100 g/L稀釋樣品,渦旋均質(zhì),用無菌紗布(4層)過濾掉雜質(zhì),得到的糞便勻漿用于接種。此研究方案已由無錫市第二人民醫(yī)院倫理委員會審批通過,并且從每位參與研究的志愿者處獲得了書面知情同意書。
1.3.2 OGs和OGOs的體外發(fā)酵
體外發(fā)酵糞便微生物的方法參考YANG等[16]的方法,略有修改。以添加OGs/OGOs為碳源的培養(yǎng)基,體外發(fā)酵健康人和2型糖尿病人糞便微生物。以菊粉為陽性對照組、無碳源為空白對照組。體外發(fā)酵是在厭氧管中進行的,工作體積為5.5 mL。碳源的添加量為5.0 g/L,基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L)包括:2 g胰蛋白胨,2 g酵母提取物,0.1 g NaCl,0.04 g K2HPO4,0.04 g KH2PO4,0.01 g MgSO4·7H2O,0.01 g CaCl2·6H2O,2 g NaHCO3、2 mL吐溫80、0.025 g氯化血紅素,0.002 g維生素K1、0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽,0.5 g膽汁鹽和4 mL刃天青溶液(0.25 g/L),pH 6.8~7.0。每個厭氧管中注入添加相應(yīng)碳源后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL,滅菌。將準備好的糞漿接種液按10%的接種量分別接入到培養(yǎng)基中,在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)。在發(fā)酵0和48 h,取出樣品測定pH、總糖含量、產(chǎn)氣量、SCFA含量等。其中pH用pH計直接測定,總糖含量采用苯酚硫酸法[17]測定。以上所有實驗,均1式3份進行。
參考RYCROFT等[18]的方法。將裝有無菌針的活塞注射器插入到每個培養(yǎng)瓶的橡膠塞中,在發(fā)酵過程中,伴隨著產(chǎn)氣體積的增加,培養(yǎng)瓶的頂部壓力增加,推動注射器活塞上移,進而達到測產(chǎn)氣量的目的。
將每個待測樣品的發(fā)酵液取出1 mL,以13 000 r/min離心3 min,并將上清液貯存在-20 ℃,備用。將上清液(1 mL)中加入10 μL內(nèi)標(100 mmol/L 2-乙基丁酸)和250 μL HCl溶液,用1 mL無水乙醚萃取目標產(chǎn)物,分離出有機相,加入無水Na2SO4除水,過0.22 μm有機系濾膜。使用配備有氫火焰檢測器(flame ionization detector,FID)的氣相色譜儀定量測量樣品,載氣為N2,分流比20∶1,流速為1.5 mL/min,采用熔融石英毛細管色譜柱(Agilent,HP-INNOWAX,30 m×0.25 mm×0.25 μm)。溫度程序如下:以20 ℃/min從60 ℃升溫到190 ℃,維持4 min。檢測器溫度250 ℃,進樣口溫度220 ℃,進樣量為5 μL。使用集成的安捷倫數(shù)據(jù)庫記錄和處理數(shù)據(jù)。乙酸、丙酸和丁酸濃度根據(jù)相同條件下測定的標準曲線確定。
1.6.1 DNA的提取
分別提取健康組和糖尿病組接種液的基因組DNA,以及每份發(fā)酵樣品發(fā)酵48 h后的基因組DNA。采用TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒,根據(jù)生產(chǎn)商的操作步驟提取DNA,將提取的基因組DNA貯存在-20 ℃,備用。
1.6.2 實時熒光定量PCR條件
每份發(fā)酵樣品的每個擴增反應(yīng)均1式3份進行。反應(yīng)體系10 μL:Fast SYBR Green Master Mix 5 μL,20 μmol/L上下游引物各0.2 μL,DNA模板0.5 μL,ddH2O 4.1 μL。反應(yīng)條件:先在95 ℃下進行120 s的預(yù)變性,然后95 ℃進行3 s、60 ℃退火延伸30 s,共40個循環(huán)。最后進行溶解曲線分析,判斷擴增子特異性。在95 ℃下進行15 s,60 ℃下保持1 min后以0.3 ℃逐漸加熱,直到95 ℃,在此溫度下保持15 s。由系統(tǒng)軟件StepOne Software v2.3自動分析CT值。表1列出了使用的16S rRNA靶向引物。
表1 本實驗使用的16S rRNA靶向引物Table 1 16S rRNA gene primers used in this study
1.6.3 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理
參考VIGSNAES等[19]的相對定量方法。靶向引物編碼的16S rRNA序列對應(yīng)的目標菌的相對含量,由E-ΔCT計算得到。其中ΔCT是相應(yīng)細菌的CT值減去總細菌的CT值;E是引物效率,E=10-1/s,s是該引物對應(yīng)標準曲線的斜率。標準曲線測定方法:將其中1個發(fā)酵樣品的基因組DNA稀釋10n倍,用同樣方法進行實時熒光定量PCR,以CT-lg(1/10n)作圖。
以上所述實驗均獨立重復(fù)3次,采用SPSS 22軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)分析方差,采用Tukey HSD法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。
OGs和OGOs分別通過熱水浸提法和OGs酸解制得。圖2為OGs的多角度激光散射凝膠色譜譜圖,采用系統(tǒng)軟件ASTRA 5.3.4分析,表明OGs的分子質(zhì)量為1.34×105Da。OGOs的MALDI-TOF質(zhì)譜譜圖如圖3所示,分析可知OGOs是由聚合度為3~11的β-葡寡糖組成。
圖2 OGs多角度激光散射凝膠色譜譜圖Fig.2 Multi-angle laser scattering gel chromatogram of OGs
圖3 OGOs的MALDI-TOF質(zhì)譜譜圖Fig.3 MALDI-TOF mass spectrum of OGOs
分別以O(shè)Gs、OGOs和菊粉為培養(yǎng)基碳源,對健康人和2型糖尿病人來源的糞便菌群進行體外厭氧發(fā)酵。通過測定0和48 h各組發(fā)酵液中的總糖含量(表2),計算出健康人和2型糖尿病人糞便菌群發(fā)酵48 h后對不同碳源的利用情況。發(fā)酵48 h后,OGs的利用率在健康組和糖尿病組分別為96.29%和95.07%,OGOs的利用率在健康組和糖尿病組分別為93.92%和94.66%,菊粉在2組的利用率分別為92.89%和93.05%??梢钥闯?,健康組和2型糖尿病組的腸道菌群都可以較好地利用OGs、OGOs和菊粉。
表2 健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發(fā)酵0和48 h后發(fā)酵液的總糖含量Table 2 Total carbohydrate content in fermented brothof healthy and type 2 diabetics after fecal flora fermentationwith different carbon sources for 0 and 48 h
通過測定0和48 h各組發(fā)酵液的pH(表3),可以發(fā)現(xiàn),在無碳源添加(空白)的情況下,各組發(fā)酵液的pH略微下降;以O(shè)Gs、OGOs和菊粉為碳源進行糞菌發(fā)酵,各組發(fā)酵液的pH均明顯降低,其中健康組以O(shè)Gs和菊粉為碳源的發(fā)酵液pH明顯低于OGOs組;2型糖尿病組以O(shè)Gs為碳源的發(fā)酵液pH明顯低于OGOs組和菊粉組。以上結(jié)果說明,OGs和OGOs可能對結(jié)腸環(huán)境pH的降低有作用,結(jié)腸pH降低可以抑制病原菌,改善結(jié)腸環(huán)境[22]。
表3 健康人和糖尿病人糞便菌群以不同碳源發(fā)酵0和48 h后發(fā)酵液的pHTable 3 pH value of fermented broth of healthyand type 2 diabetics after fecal flora fermentation withdifferent carbon sources for 0 and 48 h
健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發(fā)酵48 h后,對各發(fā)酵體系的產(chǎn)氣量進行測定,結(jié)果如圖4所示,健康人的糞便菌群在分別利用3種不同碳源后,在產(chǎn)氣量上沒有顯著差異。但是2型糖尿病人的糞便菌群在分別利用3種不同碳源發(fā)酵后,在產(chǎn)氣量方面有較大差異:OGs組發(fā)酵體系的產(chǎn)氣量顯著低于菊粉組(P<0.05);另外,OGOs組的產(chǎn)氣量也明顯低于菊粉組(P=0.087);而OGs組與OGOs組的產(chǎn)氣量則無明顯差異。說明相比于菊粉,2型糖尿病人糞便菌群以O(shè)Gs和OGOs為碳源發(fā)酵會產(chǎn)生較少氣體,這與文獻[23]報道的以葡聚糖或葡寡糖為碳源發(fā)酵糞菌比菊粉產(chǎn)氣量少的研究結(jié)果相一致。
圖4 健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發(fā)酵48 h后的產(chǎn)氣量Fig.4 Gas production of healthy and type 2 diabeticsafter fecal flora fermentation with different carbon sourcesfor 48 h注:同一組中標注的不同字母表示顯著差異(P<0.05)(下同)
腸道微生物發(fā)酵碳水化合物的主要代謝產(chǎn)物是SCFAs,主要包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs在調(diào)節(jié)宿主代謝、降低結(jié)腸pH、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和細胞增殖方面具有關(guān)鍵作用[24]。采用氣相色譜法定量測定了健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發(fā)酵48 h后的發(fā)酵液中乙酸、丙酸以及丁酸的濃度,結(jié)果如圖5所示。從圖5-a和圖5-b可以看出,相比于空白組,以O(shè)Gs、OGOs和菊粉為碳源發(fā)酵糞菌,健康人和2型糖尿病人糞便菌群發(fā)酵液中乙酸和丙酸濃度均顯著增加。由圖5-a不難看出,以O(shè)Gs和OGOs為碳源發(fā)酵48 h后,健康人糞菌發(fā)酵液中OGs組和OGOs組乙酸濃度無顯著差異,而2型糖尿病人糞菌發(fā)酵液中,OGOs組乙酸濃度顯著高于OGs組。同樣,由圖5-b可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)過48 h發(fā)酵后,2型糖尿病人糞菌發(fā)酵液中,OGOs組丙酸濃度顯著高于OGs組。圖5-c表明,與OGOs和菊粉相比,以O(shè)Gs為碳源時,健康組和2型糖尿病組糞便菌群發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中丁酸濃度均顯著增加。綜合以上結(jié)果,OGs和OGOs對腸道菌群代謝產(chǎn)SCFAs均有顯著的促進作用,其中,以O(shè)Gs為碳源,可以顯著促進健康人和2型糖尿病人腸道菌群產(chǎn)丁酸;與OGs相比,以O(shè)GOs為碳源則可以顯著促進2型糖尿病人腸道菌群產(chǎn)乙酸和丙酸。
采用實時熒光定量PCR方法,測定了健康人和2型糖尿病人初始糞便菌群(0 h)和以不同碳源發(fā)酵糞菌48 h后發(fā)酵液中Firmicutes phylum、Bacteroidetes phylum、Lactobacillusspp.、Bifidobacteriumspp.以及主要產(chǎn)丁酸菌屬Clostridiumleptumsubgroup(C.leptumsubgroup)相對于總細菌的含量,結(jié)果如圖6和圖7所示。
圖5 健康人和2型糖尿病人糞便菌群利用不同碳源發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中SCFAs含量Fig.5 SCFAs content in fermented broth of healthy and type 2 diabetics after fecal flora fermentationwith different carbon sources for 48 h
圖6 健康人和2型糖尿病人糞便菌群中各細菌相對總細菌的含量Fig.6 Relative quantities of target bacteria to totalbacteria in feces of healthy and type 2 diabetics注:各細菌相對總細菌的含量,由E-ΔCT計算得到。其中ΔCT是相應(yīng)細菌的CT值減去總細菌的CT值;E是引物效率,E=10-1/s, s是該引物對應(yīng)標準曲線的斜率。總細菌的相對含量為100%
從圖6中可以看出,與健康人相比,2型糖尿病人糞便菌群中厚壁菌門減少,擬桿菌門增多,乳酸桿菌和雙歧桿菌減少,但是差異均不顯著。但2型糖尿病人腸道菌群中產(chǎn)丁酸菌C.leptumsubgroup與健康人相比,相對含量顯著降低,健康組為35.05%,2型糖尿病組僅為2.42%。由此結(jié)果得出,相比于健康人,2型糖尿病患者糞便菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值(F/B值)下降,乳酸桿菌、雙岐桿菌含量減少,產(chǎn)丁酸菌含量顯著降低。以上結(jié)果與QIN等[25]關(guān)于2型糖尿病人產(chǎn)丁酸菌含量顯著下降的研究結(jié)果一致。FURET等[26]的研究結(jié)果也表明,2型糖尿病患者糞便菌群中F/B值下降,這是腸道菌群失調(diào)的重要標志之一[3]。以上結(jié)果表明,本研究中涉及到的2型糖尿病人的腸道菌群呈現(xiàn)中度失調(diào)。
從圖7可以看出,經(jīng)過48 h發(fā)酵后,健康組和2型糖尿病組的乳酸桿菌和雙歧桿菌的相對含量均(比0 h時)顯著提高,其中健康組以菊粉和OGOs為碳源效果最佳,2型糖尿病組以O(shè)GOs為碳源提高作用最為顯著。以O(shè)Gs和OGOs為碳源,健康人和2型糖尿病人糞便菌群中產(chǎn)丁酸菌C.leptumsubgroup相對總細菌的含量均顯著提高,其中,OGs組對產(chǎn)丁酸菌相對含量的提高作用顯著高于OGOs組。綜合以上結(jié)果,OGs和OGOs對健康人和2型糖尿病人糞便菌群組成有不同的調(diào)控作用:OGs對糞便菌群產(chǎn)丁酸菌豐度提高作用顯著,這一結(jié)果與OGs可以顯著提高糞便菌群發(fā)酵液中丁酸含量相對應(yīng);OGOs對糞便菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用較好。
a-健康組;b-2型糖病組圖7 健康人和2型糖尿病人糞便菌群利用不同碳源發(fā)酵0和48 h后各細菌相對總細菌的含量Fig.7 Relative quantities of target bacteria to totalbacteria in feces of healthy and type 2 diabetics fermentedwith different carbon sources for 0 and 48 h注:“OGs”、“OGOs”、“菊粉”、“空白”為以對應(yīng)的碳源發(fā)酵48 h后各細菌相對總細菌的含量;“0 h”為糞便菌群發(fā)酵0 h,即健康人和2型糖尿病人原始腸道菌群中各細菌相對總細菌的含量
本研究通過以O(shè)Gs及其水解產(chǎn)物OGOs為碳源,對菌群結(jié)構(gòu)相對平衡的健康人糞便菌群和菌群中度失調(diào)的2型糖尿病人糞便菌群進行體外發(fā)酵,探究了OGs及OGOs對健康人和2型糖尿病人腸道菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物的影響。通過檢測體外發(fā)酵48 h后的發(fā)酵液pH、發(fā)酵體系產(chǎn)氣量、SCFAs含量和菌群組成變化,發(fā)現(xiàn)OGs和OGOs均可以明顯改善健康人和2型糖尿病人的腸道菌群結(jié)構(gòu),并對腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs的產(chǎn)生有明顯的促進作用。由于OGs和OGOs在結(jié)構(gòu)上存在聚合度和分支率的差異,它們在腸道菌群中可能有不同的酵解途徑,進而對腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生不同的影響:與OGOs相比,OGs可以顯著提高腸道菌群中產(chǎn)丁酸菌C.leptumsubgroup相對總細菌的含量,進而提高發(fā)酵液中丁酸的濃度;OGOs則較好地增加了腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌相對含量,并提高了發(fā)酵液中乙酸和丙酸的濃度。研究還發(fā)現(xiàn),OGs和OGOs對腸道菌群的改善效果隨菌群來源不同而有所差別:OGs對產(chǎn)丁酸菌豐度的提高作用在健康人腸道菌群中較為顯著;OGOs對乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用以及對腸道菌群產(chǎn)乙酸和丙酸的促進作用,在2型糖尿病人腸道菌群中較顯著。綜合以上結(jié)論,OGs和OGOs對腸道菌群的組成和代謝有不同的改善作用,這種改善作用隨腸道菌群來源不同而有所差別,OGs和OGOs可能可以有針對性地改善2型糖尿病人腸道菌群的結(jié)構(gòu)和相關(guān)代謝。