劉潔，王宏濤，錢和，徐建中*，張偉國(guó)*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

β-胡蘿卜素(β-carotene)具有多種關(guān)鍵的生物學(xué)功能[1]，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、保健品和飼料添加劑[2]。近年來，有研究報(bào)道β-胡蘿卜素具有預(yù)防癌癥、心血管疾病和抗衰老的功效[3]，因此其市場(chǎng)需求急劇增加。然而，提取法和化學(xué)合成法生產(chǎn)β-胡蘿卜素存在產(chǎn)量低及食品安全等問題[4-5]。近年來，隨著代謝工程的快速發(fā)展和人們對(duì)異源表達(dá)系統(tǒng)的深入研究，構(gòu)建工程菌株異源合成β-胡蘿卜素成為熱點(diǎn)[6-7]。目前，用于異源生產(chǎn)β-胡蘿卜素的模式菌株主要是大腸桿菌和釀酒酵母，但由于存在缺少蛋白修飾、培養(yǎng)條件較復(fù)雜及發(fā)酵規(guī)模不易擴(kuò)大等問題而不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[8-9]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成本低、周期短、表達(dá)量高且可高密度培養(yǎng)，為大規(guī)模生產(chǎn)β-胡蘿卜素帶來了希望[10-12]。ARAYA-GARAY等[12]首次構(gòu)建了異源表達(dá)歐文氏菌類胡蘿卜素相關(guān)基因的巴斯德畢赤酵母突變菌株，所得菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量?jī)H為339 μg/g(DCW)。我們預(yù)測(cè)，引入鎖擲酵母類胡蘿卜素途徑可以獲得更高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的重組巴斯德畢赤酵母。

本研究首次克隆來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因并在巴斯德畢赤酵母中異源表達(dá)以產(chǎn)生β-胡蘿卜素，并探索單個(gè)或多個(gè)類胡蘿卜素基因?qū)Ζ?胡蘿卜素生產(chǎn)的影響。這項(xiàng)研究為基于代謝工程異源合成β-胡蘿卜素提供了新的案例并有望推進(jìn)β-胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus) JD2保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)，記錄號(hào)為CCTCC M2010326；大腸桿菌DH5α、野生型巴斯德畢赤酵母X-33和大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pGAPZA、pPIC9k購(gòu)自Invitrogen。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶，Thermo Scientific；TaqDNA聚合酶、DNA Mark、MutExpress?快速誘變?cè)噭┖小NA切膠回收試劑盒、cDNA合成試劑盒,Vazyme；T4DNA連接酶、酵母RNA提取試劑盒,TaKaRa；PCR引物、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?上海生工；酵母基因組提取試劑盒,康為世紀(jì)；qPCR染料試劑盒,BBI；博來霉素、卡那霉素,Invitrogen；標(biāo)準(zhǔn)品β-胡蘿卜素、玻璃珠,Sigma；色譜純二氯甲烷、乙腈,國(guó)藥沃凱；其他試劑均為國(guó)藥分析純。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；真空冷凍干燥機(jī)，日本Toshiba公司；高效液相色譜儀，德國(guó)Agilent公司；電脈沖基因轉(zhuǎn)移儀，美國(guó)BIO-RAD公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.3 培養(yǎng)基

LLB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5.0，NaCl 5.0；YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；BMGY培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母膏10，甘油10，YNB 13.4，生物素0.5，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)。

1.4 β-胡蘿卜素表達(dá)載體的構(gòu)建

提取鎖擲酵母總RNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性。合成第1條鏈cDNA，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物(表1)。通過PCR獲得含有相應(yīng)限制位點(diǎn)的crtE、crtYB和crtI基因片段，并通過測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本實(shí)驗(yàn)用于PCR的引物Table 1 Primers used in this experiment for PCR

質(zhì)粒pGAPZA的定點(diǎn)誘變按照制造商的說明進(jìn)行，以產(chǎn)生不含有AvrⅡ位點(diǎn)的載體pGAPZA*并通過DNA測(cè)序驗(yàn)證。將基因片段與載體連接以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pGAPZA-E，pGAPZA*-I和pGAPZA*-YB，將來自pGAPZA*-I和pGAPZA*-YB的表達(dá)盒無縫克隆到pGAPZA-E的BamHⅠ位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pGAPZA-EYBI(圖1)。

圖1 質(zhì)粒pGAPZA-EYBI構(gòu)建過程Fig.1 Construction of plasmid pGAPZA-EYBI

1.5 巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選

用AvrⅡ?qū)GAPZA-EYBI線性化，按照ARAYA-GARAY等[12]的方法進(jìn)行巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和電穿孔。電擊后，立即加入1 mL預(yù)冷的無菌山梨糖醇，混合物30 ℃靜置1 h，涂布在含有100 μg/mL博來霉素的YPD板上。將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中2～4 d以篩選重組菌落。使用快速酵母基因組DNA分離試劑盒提取巴斯德畢赤酵母基因組DNA，并通過PCR驗(yàn)證基因整合到基因組中。

1.6 細(xì)胞質(zhì)量濃度測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尯?，以清水作為?duì)照,測(cè)定OD600值。取1 mL發(fā)酵液于10 000 r/min下離心，棄上清液，用清水洗滌2次后于烘箱中90 ℃烘干至恒重，得到菌體干重。

1.7 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

在參考文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)，進(jìn)行β-胡蘿卜素提取。培養(yǎng)72 h后，離心菌體用雙蒸水洗滌2次，收集細(xì)胞進(jìn)行冷凍干燥。將細(xì)胞干粉溶于1 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并加入玻璃珠渦旋1 min，55 ℃提取30 min，重復(fù)提取直至細(xì)胞無色。萃取液在氮?dú)饬飨赂稍?，然后溶解在丙酮中進(jìn)行HPLC分析。在配備有ZORBAX SB-C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm) 的Agilent Technologies 1 260 Infinity HPLC系統(tǒng)上于30 ℃進(jìn)行β-胡蘿卜素分離和定量。流動(dòng)相由溶劑A(乙腈) 和溶劑B(二氯甲烷)組成[14]，梯度程序如下：A在10 min內(nèi)從100%到50%線性梯度洗脫5 min；然后回到100%。流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，通過比較樣品和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行定量分析。

1.8 β-胡蘿卜素合成途徑中crt基因的qPCR分析

菌株在YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用酵母RNA提取試劑盒提取重組畢赤酵母總RNA并合成cDNA第1條鏈。將引物(表2)和熒光染料添加到cDNA中進(jìn)行qPCR。

表2 本實(shí)驗(yàn)用于qPCR的引物Table 2 Primers used in this experiment for qPCR

為了校正起始量的差異，將核糖體18S RNA作為管家基因。通過溶解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性，并且通過2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析[15]。

1.9 重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高重組畢赤酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，對(duì)影響酵母生長(zhǎng)和表達(dá)的重要因素進(jìn)行優(yōu)化。將重組菌接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min下過夜培養(yǎng)作為種子液。以5%的接種量接種于含有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。選取合適的梯度范圍進(jìn)行單因素優(yōu)化[16-19]，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，分別測(cè)定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎖擲酵母類胡蘿卜素基因的克隆與序列分析

常用于異源合成β-胡蘿卜素的類胡蘿卜素基因主要來自歐文氏菌(Erwiniauredovora)和紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)[12]。據(jù)報(bào)道，鎖擲酵母合成類胡蘿卜素的能力更強(qiáng)，這表明其類胡蘿卜素基因可能更適合于β-胡蘿卜素的合成[20]。通過逆轉(zhuǎn)錄從鎖擲酵母中獲得crtE(KY652916.1)、crtYB(KR108013.1)和crtI(KR108014.1)(圖2)。為了了解鎖擲酵母類胡蘿卜素基因，進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì),如圖3所示。

1-crtI；2-crtYB；3-crtE圖2 鎖擲酵母類胡蘿卜素基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of target gene amplification andrecombinant plasmid verification

來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因與來自X.dendrorhous和E.uredovora的類胡蘿卜素基因具有較高的同源性，推測(cè)其活性位點(diǎn)一致。另外，鎖擲酵母高效的類胡蘿卜素合成途徑顯示出其編碼酶基因可能具有更高的催化活性。

2.2 巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素生物合成途徑的構(gòu)建

巴斯德畢赤酵母中不存在天然質(zhì)粒，外源基因需要整合在基因組中進(jìn)行表達(dá)[12]。因此，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒pGAPZA-EYBI，將其整合到巴斯德畢赤酵母基因組中以獲得重組菌株P(guān)p-EYBI。Pp-EYBI在BMGY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)72 h，用于色素提取。

a- crtE氨基酸序列比對(duì);b- crtYB氨基酸序列比對(duì);c- crtI氨基酸序列比對(duì)圖3 不同來源的類胡蘿卜素基因氨基酸多序列比對(duì)Fig.3 Amino acid multiple sequence alignment of carotenoid genes from different sources

如圖4所示，HPLC分析表明，重組畢赤酵母Pp-EYBI中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為818 μg/gDCW，是ARAYA-GARAY等[12]先前報(bào)道的2.4倍。這些結(jié)果證實(shí)，由于宿主偏好和相關(guān)酶的催化活性，來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因在巴斯德畢赤酵母中表現(xiàn)更好。

2.3 重組畢赤酵母β-胡蘿卜素合成限速酶基因的確定

編碼限速酶基因的過表達(dá)是代謝工程提高產(chǎn)量的重要策略之一[21]。為確定重組巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素合成的限速步驟，構(gòu)建了重組菌株P(guān)p-EYBI+I和Pp-EYBI+YB。搖瓶培養(yǎng)72 h后，HPLC結(jié)果顯示，菌株P(guān)p-EYBI+YB中β-胡蘿卜素產(chǎn)量增至1 576 μg/gDCW，而Pp-EYBI+I菌株中β-胡蘿卜素積累量下降了16%。

a- β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品;b- 重組菌株P(guān)p-EYBI中提取的色素圖4 β-胡蘿卜素HPLC色譜圖Fig.4 β-carotene HPLC chromatogram

為了確定類胡蘿卜素基因是否正確表達(dá)并進(jìn)一步了解產(chǎn)生不同β-胡蘿卜素的原因，分別在Pp-EYBI、Pp-EYBI+I和Pp-EYBI+YB菌株中研究了crt基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)。在野生型細(xì)胞中，無法檢測(cè)到crtE、crtYB和crtI的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。與Pp-EYBI相比，Pp-EYBI+I菌株中crtE和crtI基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，而crtYB基因幾乎不變。相反，Pp-EYBI+YB菌株中crtYB基因的表達(dá)水平比Pp-EYBI細(xì)胞高2.44倍。這些結(jié)果表明，crtYB是菌株P(guān)p-EYBI合成β-胡蘿卜素的限速酶編碼基因。

圖5 不同重組菌株中β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription levels of β-carotene synthesis-related genes in different recombinant strains

2.4 β-胡蘿卜素合成限速酶基因拷貝數(shù)的優(yōu)化

為進(jìn)一步提高重組巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，連續(xù)引入限速酶基因crtYB。SacⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切將AOX1啟動(dòng)子和α因子替換為GAP啟動(dòng)子，構(gòu)建了基于pPIC9k攜帶crtYB的質(zhì)粒pPIC9k-YB并電轉(zhuǎn)到Pp-EYBI+YB的感受態(tài)細(xì)胞中，因其所帶抗性為卡那霉素而不是博來霉素，從而保證篩選順利進(jìn)行。隨后的研究表明，菌株P(guān)p-EYBI+(YB)2中crtYB表達(dá)水平是Pp-EYBI的3.32倍，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到2.5 mg/gDCW，比Pp-EYBI菌株的產(chǎn)量高310%。結(jié)果表明，Pp-EYBI+YB菌株中crtYB拷貝數(shù)的增加提高了其表達(dá)量表達(dá)，從而提高了流向β-胡蘿卜素的通量。為了研究crtYB是否仍然是Pp-EYBI+(YB)2中的限速步驟，構(gòu)建菌株P(guān)p-EYBI+(YB)3。盡管crtYB的表達(dá)水平高達(dá)Pp-EYBI的4.53倍，Pp-EYBI+(YB)3中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量略有下降，但純度較高(圖6)。推測(cè)原因可能是合成β-胡蘿卜素前體物質(zhì)供應(yīng)不足所致。

圖6 不同重組菌株合成β-胡蘿卜素的能力Fig.6 The ability of different recombinant strains tosynthesize β-carotene

2.5 β-胡蘿卜素合成前體物質(zhì)供應(yīng)的增強(qiáng)

HMG1基因是MVA途徑的限速酶基因，截短的HMG1(tHMG1)基因可以有效解除麥角固醇的反饋抑制提高M(jìn)VA路徑的通量[22]。為提高工程菌Pp-EYBI+(YB)3中β-胡蘿卜素合成的前體物質(zhì)供應(yīng)，克隆來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C的tHMG1基因(圖7)。構(gòu)建質(zhì)粒pGAPZA-H電轉(zhuǎn)到Pp-EYBI+(YB)3感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組菌株P(guān)p-EYBI+(YB)3H。結(jié)果顯示，Pp-EYBI+(YB)3H中β-胡蘿卜素產(chǎn)量為3.7 mg/gDCW，是Pp-EYBI+(YB)2的1.48倍。

M-marker;1-tHMG1圖7 目的基因tHMG1擴(kuò)增電泳圖Fig.7 Electrophoresis of target gene tHMG1 amplification

2.6 單因素試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，對(duì)重組菌株P(guān)p-EYBI+(YB)3H搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化。優(yōu)化條件為：甘油添加的體積分?jǐn)?shù)為2%，最適pH 6.0；接種量10%，裝液量50 mL；轉(zhuǎn)速200 r/min；溫度28 ℃。

3 結(jié)論

本研究將來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素合成途徑引入巴斯德畢赤酵母中以獲得產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌株。這是首次報(bào)道克隆鎖擲酵母來源的類胡蘿卜素基因并用于異源生產(chǎn)β-胡蘿卜素。本研究對(duì)β-胡蘿卜素合成限速酶基因crtYB拷貝數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并過表達(dá)MVA途徑限速酶基因tHMG1以提高類胡蘿卜素合成前體物質(zhì)的供應(yīng)，最終成功構(gòu)建一株重組畢赤酵母Pp-EYBI+(YB)3H，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到3.7 mg/gDCW，是ARAYA-GARAY等[12]報(bào)道的10.9倍。本研究構(gòu)建的巴斯德畢赤酵母工程菌培養(yǎng)基組分成本低廉，成分簡(jiǎn)單，方便后期分離純化，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素提供了新的策略。