姜聰，郭愛(ài)玲，魏雪團(tuán)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)，是生物體內(nèi)含硫氨基酸代謝的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，由甲硫氨酸和三磷酸腺苷通過(guò)蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶合成[1]。SAM在細(xì)胞中主要參與轉(zhuǎn)甲基化[2]、轉(zhuǎn)硫化[3]和脂肪多胺合成[4]，被視為生物體中的關(guān)鍵代謝物，常用于預(yù)防和改善肝病、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥、阿爾茨海默氏癥等多種疾病[5-7]。歐美國(guó)家已將其批準(zhǔn)用作膳食補(bǔ)充劑[8]。因此，開(kāi)發(fā)SAM相關(guān)產(chǎn)品具有重要的意義。

微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)SAM的主要方法。早期的研究普遍通過(guò)添加大量甲硫氨酸前體物來(lái)實(shí)現(xiàn)SAM的高效合成，產(chǎn)量可達(dá)10 g/L以上[9]，但甲硫氨酸添加量大、成本高，且轉(zhuǎn)化率低，導(dǎo)致SAM價(jià)格昂貴[10]。進(jìn)而有研究者以廉價(jià)糖類碳源從頭合成SAM，以期降低發(fā)酵成本[11]。然而，目前從頭合成SAM的產(chǎn)量仍較低，尚需開(kāi)展深入研究。課題組前期通過(guò)解淀粉芽胞桿菌從頭合成SAM，通過(guò)途徑耦合代謝工程策略強(qiáng)化了SAM的合成[12]，該法在SAM的從頭合成中具有重要的應(yīng)用潛力，但仍需開(kāi)展大量研究工作。

解淀粉芽胞桿菌可大量合成兩親性脂肽類表面活性劑副產(chǎn)物[13]，不僅消耗大量的能量，而且這些表面活性劑可導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程起泡嚴(yán)重，影響發(fā)酵過(guò)程[14]。芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類表面活性劑主要包括iturin和surfactin，其中iturin主要由ituDABC操縱子基因編碼[15-16]，surfactin主要由srfA-ABCD操縱子基因編碼[17-18]。通過(guò)基因敲除技術(shù)阻斷iturin和surfactin的合成有望促進(jìn)SAM的合成，然而目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)基因敲除技術(shù)敲除解淀粉芽孢桿菌中的ituD和SrfAC基因，阻斷iturin和surfactin的合成，以期降低發(fā)酵過(guò)程脂肽類副產(chǎn)物和發(fā)酵泡沫，以期提高SAM產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用到的菌株和質(zhì)粒如表1和表2所示。其中大腸桿菌DH5α用于構(gòu)建載體。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

注：Tetr：四環(huán)素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：溫敏型復(fù)制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物見(jiàn)表3。

表3 本研究所使用的PCR引物Table 3 Primers used for PCR in this study

注：粗體為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，劃線為重疊延伸PCR (SOE-PCR)的重疊區(qū)域

1.1.3 主要培養(yǎng)基

SAM發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖80，蛋白胨10，玉米漿5，天冬氨酸3，尿素2，NaCl 2.5，(NH4)2SO46.3，KH2PO43，MgSO4·7H2O 4.2，pH 6.5。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%。

1.1.4 工具酶和試劑

DNA抽提試劑盒,武漢楚誠(chéng)正茂科技工程有限公司；TransStartR FastPfuDNA聚合酶和TransStartR easyTaqDNA聚合酶,北京全式金公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶，DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒，美國(guó)OmegaBio-Tek公司；DL5000 Marker，TaKaRa公司；瓊脂糖，Spanish公司；Kan、Tet、溶菌酶、山梨醇、甘露醇等試劑等均為進(jìn)口分裝，武漢楚誠(chéng)正茂科技工程有限公司，biosharp；甲醇為色譜級(jí)，其他主要生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)純或進(jìn)口分裝。

1.1.5 儀器與設(shè)備

Agilent Technologies 1260高效液相色譜，美國(guó)Agilent公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀，美國(guó) Bio-Rad 公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 敲除載體的構(gòu)建

以ituD基因?yàn)槔?，選取B.amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，利用上游同源臂引物(ΔituD-AF, ΔituD-AR)和下游同源臂引物(ΔituD-BF，ΔituD-BR)分別擴(kuò)增出同源臂序列A和B，產(chǎn)物純化回收后通過(guò)SOE-PCR用引物ΔituD-AF、ΔituD-BR將A和B連接起來(lái)，并與T2(2)-ori載體同時(shí)用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。鈣轉(zhuǎn)化成功后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并送往測(cè)序公司測(cè)序，構(gòu)建成功的敲除質(zhì)粒命名為T(mén)2(2)-oriΔituD。

1.2.2 基因敲除菌株的構(gòu)建[12]

以ituD基因?yàn)槔瑢?gòu)建成功的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入HSAM4感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h。挑選轉(zhuǎn)化子單菌落于Kan平板上劃線，培養(yǎng)8～12 h后進(jìn)行PCR菌落驗(yàn)證(引物T2-F,T2-R)。將電轉(zhuǎn)正確的菌株在45 ℃下進(jìn)行單交換，ΔituD-YF/YR引物和T2引物驗(yàn)證；獲得的單交換菌株在37 ℃下進(jìn)行雙交換，挑選在LB板上長(zhǎng)而在Kan抗性板上不長(zhǎng)的單菌落，用ΔituD-YF和ΔituD-YR驗(yàn)證，篩選到敲除菌株，命名為HSAM4ΔituD。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)基12 h。挑取適量菌體于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)9 h。吸取體積分?jǐn)?shù)1.5%的菌液接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，每個(gè)菌設(shè)置3個(gè)搖瓶重復(fù)。

1.2.4 SAM液相檢測(cè)[12]

取發(fā)酵液0.5 mL，加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸，提取1 h(每15 min振蕩1次)，10 000 r/min離心5 min。取800 μL上清液，加100 μL，2 mol/L NaOH調(diào)pH。利用HPLC檢測(cè)，色譜柱為XDB-C18(規(guī)格：5 μm，4.6 mm×150 mm)，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(40 mmol/L NH4H2PO42 mmol/L庚烷磺酸鈉)=18∶82，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估數(shù)據(jù)差異的顯著性，計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ituD基因缺失對(duì)解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.1.1ituD基因缺失菌株的構(gòu)建

利用1.2.1小節(jié)中所述的方法構(gòu)建重組載體T2(2)-oriΔituD，利用表3中相應(yīng)的引物ΔituD-AF/AR，ΔituD-BF/BR擴(kuò)增用于構(gòu)建T2(2)-oriΔituD的上下游同源臂。敲除ituD基因的上下游同源臂大小分別為513和504 bp，上下游同源臂經(jīng)SOE-PCR融合后的產(chǎn)物大小為1 017 bp，上下游同源臂SOE-PCR融合片段與T2(2)-ori質(zhì)粒經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，選取驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并且測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤，表明敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔituD構(gòu)建成功。

將已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔituD電轉(zhuǎn)化至HASM4中，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并按照1.2.2的方法進(jìn)行單交換和雙交換篩選突變株。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應(yīng)的引物ΔituD-YF/YR驗(yàn)證原始菌株HSAM4和陽(yáng)性交換突變株，片段大小分別為2 508、1 290 bp，兩片段相差的長(zhǎng)度正好是ituD基因的長(zhǎng)度，PCR驗(yàn)證電泳圖如圖1所示。且純化回收陽(yáng)性交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)堿基正確無(wú)誤，說(shuō)明缺失ituD基因的菌株HSAM4ΔituD構(gòu)建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗(yàn)證HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗(yàn)證HSAM4ΔituD(1 290 bp)圖1 HSAM4ΔituD菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituD

2.1.2ituD基因缺失對(duì)SAM合成的影響

為了考察ituD基因的缺失對(duì)B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影響，按照1.1.3和1.2.3小節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HSAM4ΔituD進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期為60 h。發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測(cè)SAM產(chǎn)量和菌體生物量(OD600)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 缺失ituD基因?qū)AM合成的影響Fig.2 Effect of ituD knockout on SAM fermentation

由圖2可以看出，原始菌 HSAM4與HSAM4ΔituD的生物量無(wú)顯著差異，說(shuō)明ituD基因缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)影響。此外，缺失菌株HSAM4ΔituD的SAM產(chǎn)量與原始菌 HSAM4相比，沒(méi)有顯著性提高。上述結(jié)果說(shuō)明敲除ituD基因?qū)w生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成未產(chǎn)生顯著性影響。

2.2 srfAC基因缺失對(duì)解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.2.1srfAC基因缺失菌株的構(gòu)建

敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔsrfAC來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存。將T2(2)-oriΔsrfAC電轉(zhuǎn)化至HASM4中，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并按照1.2.2的方法進(jìn)行單交換和雙交換篩選突變株。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應(yīng)的引物ΔsrfAC-YF/YR驗(yàn)證原始菌株HSAM4和陽(yáng)性交換突變株，片段大小分別為 2 704和1 657 bp，兩片段相差的長(zhǎng)度正好是srfAC基因的長(zhǎng)度，PCR驗(yàn)證電泳圖如圖3所示。純化回收陽(yáng)性交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)堿基正確無(wú)誤，說(shuō)明缺失srfAC基因的菌株HSAM4ΔsrfAC構(gòu)建成功。

1-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗(yàn)證HSAM4(2 704 bp);2-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗(yàn)證HSAM4ΔsrfAC(1 657 bp)圖3 HSAM4ΔsrfAC菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔsrfAC

2.2.2srfAC基因缺失對(duì)SAM合成的影響

為了考察srfAC基因的缺失對(duì)B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影響，按照1.1.3和1.2.3小節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HSAM4ΔsrfAC進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期為60 h。發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測(cè)SAM產(chǎn)量和菌體生物量(OD600)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 缺失srfAC基因?qū)AM合成的影響Fig.4 Effect of srfAC knockout on SAM fermentation

由圖4可以看出，工程菌 HSAM4ΔsrfAC的生物量相比于原始菌沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。缺失菌株 HSAM4ΔsrfAC的SAM 產(chǎn)量為 208.24 mg/L，比原始菌HSAM4提高了23%，差異顯著。推測(cè)其原因，srfAC基因編碼surfactin合成酶[17]，影響脂肽的環(huán)化與釋放，減少了表面活性劑surfactin的合成，可降低副產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)泡現(xiàn)象，從而促進(jìn)SAM的合成。

2.3 ituD基因和srfAC基因雙缺失對(duì)解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.3.1ituD基因和srfAC基因雙缺失菌株的構(gòu)建

將T2(2)-oriΔsrfAC電轉(zhuǎn)化至HASM4ΔituD中，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并按照1.2.2的方法進(jìn)行單交換和雙交換篩選突變株。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應(yīng)的引物ΔituD-YF/YR和ΔsrfAC-YF/YR驗(yàn)證原始菌株HSAM4和陽(yáng)性交換突變株，與原始菌相比分別相差ituD基因和srfAC基因的長(zhǎng)度，PCR驗(yàn)證電泳圖如圖5所示。純化回收陽(yáng)性交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)堿基正確無(wú)誤，說(shuō)明缺失ituD和srfAC基因的菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC構(gòu)建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗(yàn)證HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗(yàn)證HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 290 bp);3-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗(yàn)證HSAM4(2 704 bp);4-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗(yàn)證HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 657 bp)圖5 HSAM4ΔituDΔsrfAC菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituDΔsrfAC

2.3.2ituD基因和srfAC基因雙缺失對(duì)SAM合成的影響

按照1.1.3和1.2.3小節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期為60 h。發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測(cè) SAM 產(chǎn)量和菌體生物量(OD600)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 缺失ituD,srfAC基因?qū)AM合成的影響Fig.6 Effect of ituD,srfAC knockout on SAMfermentation

由圖6可以看出，工程菌HSAM4ΔituDΔsrfAC的生物量相比于原始菌 HSAM4無(wú)明顯變化，說(shuō)明ituD和srfAC基因雙缺失對(duì)菌體的生長(zhǎng)無(wú)影響。缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM的產(chǎn)量達(dá)222.95 mg/L，相比于原始菌 HSAM4提高了32%。這可能是敲除ituD基因和srfAC基因，同時(shí)阻斷了iturin和surfactin的合成[15,17]，降低發(fā)酵副產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)泡現(xiàn)象，進(jìn)一步提高了SAM產(chǎn)量。

3 結(jié)論

S-腺苷甲硫氨酸是存在于生物體中的必需功能因子[19]。在不添加甲硫氨酸的前提下，通過(guò)廉價(jià)碳源實(shí)現(xiàn)SAM的高效從頭合成具有重要的意義。解淀粉芽胞桿菌在從頭合成SAM的過(guò)程中顯示了初步的效果[12]，為有效提高SAM的從頭合成產(chǎn)量，本文基于基因敲除技術(shù)，成功構(gòu)建了ituD基因缺失菌株HSAM4ΔituD，srfAC基因缺失菌株HSAM4ΔsrfAC，ituD、srfAC基因雙缺失菌株 HSAM4ΔituDΔsrfAC。SAM發(fā)酵結(jié)果顯示，缺失ituD、srfAC基因?qū)晟L(zhǎng)幾乎無(wú)影響，雙缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM產(chǎn)量可提高至原始菌株HSAM4的1.32倍。

ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，利用BacillussubtilisATCC 6051a發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)程中，敲除該菌株的srfAC基因可有效控制發(fā)酵過(guò)程中的泡沫。Iturin和surfactin作為兩親性脂肽類表面活性物質(zhì)，是液體深層發(fā)酵產(chǎn)泡的重要原因。由此推測(cè)，本研究ituD和srfAC基因的缺失，阻斷了iturin和surfactin的產(chǎn)生，不僅可減少發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物的生成及不必要的能量消耗，而且可通過(guò)降低表面活性劑改善發(fā)酵產(chǎn)泡現(xiàn)象，這可能是SAM產(chǎn)量提高的主要原因。本研究為SAM從頭合成的代謝工程育種提供了新的思路和方向。