盛樹海 鄭進(jìn) 佟易凡 (唐山工人醫(yī)院乳腺外科，河北 唐山 063000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高〔1〕。手術(shù)聯(lián)合放療、化療及內(nèi)分泌治療的綜合治療是乳腺癌的主要治療手段〔2〕；近年來分子靶向藥物治療因其特異性強(qiáng)，毒副作用小，基本上不損傷正常組織等優(yōu)勢(shì)得到越來越多的關(guān)注，隨著藥理學(xué)和分子生物學(xué)的深入研究，靶向藥物的研究和應(yīng)用取得了突破性進(jìn)展〔3〕。MicroRNA(miRNA)是非編碼RNA，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞分化、發(fā)育及凋亡中發(fā)揮重要作用。研究表明miRNA在乳腺癌中多種異常表達(dá)，其與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及耐藥性有關(guān)，可作為早期篩查、診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物〔4～6〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在乳腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，下調(diào)lncRNA-ATB通過增加miR-141-3p表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔7〕。但還未見miR-141-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲影響的報(bào)道。

本文旨在研究miR-141-3p與染色體同源物(CBX)1的靶向關(guān)系及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、BT474和正常人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自上海源葉生物科技有限公司；MTT試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、BT474和正常人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融和至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞MDA-MB-231，用無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-con、miR-141-3p、si-con、si-CBX1、anti-miR-con、anti-miR-141-3p分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，記為miR-con組、miR-141-3p組、si-con組、si-CBX1組、anti-miR-con組、anti-miR-141-3p組；將miR-141-3p分別與pcDNA、pcDNA-CBX1共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，記為miR-141-3p+pcDNA組、miR-141-3p+pcDNA-CBX1組。未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-141-3p和CBX1 mRNA表達(dá)水平 將培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞提取RNA，測(cè)定RNA純度和濃度后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-141-3p和CBX1分別以U6和β-actin為內(nèi)參。

1.2.4Western印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫代硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝脈電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，暗室曝光顯影，定影，Quantity One凝膠軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72、96 h時(shí)每孔分別加入20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h后加入每孔150 μl DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，然后將樣品放置在酶標(biāo)儀上，檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml。分別取200 μl細(xì)胞懸液接種于Matrigel膠包被和未包被的Transwell小室上室中，下室加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后分別用4%多聚甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡觀察拍照，并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-141-3p對(duì)CBX1的靶向調(diào)控 使用PCR擴(kuò)增包含miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)的CBX1序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得CBX1野生型載體(WT-CBX1)，將circPRKCI序列 CCAAUAGUGUUA突變?yōu)镚GUCUGUCACAAU，獲得CBX1突變型載體(MUT-CBX1)，將WT-CBX1、MUT-CBX1分別與miR-con、miR-141-3p用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中miR-141-3p和CBX1的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常乳腺細(xì)胞HBL-100相比，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和BT474中miR-141-3p mRNA表達(dá)水平顯著降低，CBX1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表1。Western印跡檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，與正常乳腺細(xì)胞HBL-100相比，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和BT474中CBX1蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。可見，乳腺癌細(xì)胞中miR-141-3p低表達(dá)，CBX1高表達(dá)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-141-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中miR-141-3p mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，從48 h起，與空白對(duì)照組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢?，miR-141-3p過表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖及相關(guān)蛋白CDK4和CyclinD1的表達(dá)。見圖2，表2。

表1 miR-141-3p和CBX1在乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)比較

與HBL-100組比較：1)P<0.05

1～4：HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、BT474圖1 正常乳腺細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞中CBX1蛋白表達(dá)

1～3：空白對(duì)照組、miR-con組、miR-141-3p組圖2 轉(zhuǎn)染miR-141-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別miR-141-3p mRNA細(xì)胞活力(OD490)培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h培養(yǎng)72 h培養(yǎng)96 hCDK4CyclinD1空白對(duì)照組0.99±0.070.35±0.370.54±0.061.18±0.081.67±0.080.84±0.080.74±0.07miR-con組1.06±0.090.34±0.340.53±0.051.09±0.091.59±0.050.81±0.070.72±0.06miR-141-3p組3.61±0.281)2)0.32±0.320.46±0.051)2)0.64±0.051)2)0.79±0.081)2)0.56±0.061)2)0.42±0.051)2)

與miR-con組相比較：1)P<0.05；與空白對(duì)照組比較：2)P<0.05，下表同

2.3轉(zhuǎn)染miR-141-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Transwell 法檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-141-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

Western印跡檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。可見，miR-141-3p過表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲及相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)。見表3。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-141-3p表達(dá)對(duì)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-141-3p可以靶向調(diào)控CBX1的表達(dá) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到CBX1與miR-141-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CBX1基因表達(dá)載體后，相較于miR-con組，miR-141-3p組WT-CBX1乳腺癌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染MUT-CBX1基因表達(dá)載體后，相較于miR-con組，miR-141-3p組MUT-CBX1乳腺癌細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。見表4。Western印跡檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示，相較于miR-con組，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中CBX1的表達(dá)水平顯著降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中CBX1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。可見，miR-141-3p可靶向調(diào)控CBX1的表達(dá)。

組別MMP-2MMP-9細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè))細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè))空白對(duì)照組0.63±0.070.78±0.06125.24±12.5378.74±6.85miR-con組0.59±0.060.75±0.07118.62±10.6784.72±6.64miR-141-3p組0.34±0.051)2)0.37±0.051)2)58.87±4.941)2)37.42±4.561)2)

2.5si-CBX1抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-con組相比，從48 h起，si-CBX1組乳腺癌細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-con組相比，si-CBX1組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見表5。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-con組相比，si-CBX1組乳腺癌細(xì)胞中CBX1、CDK4、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表5，圖7。可見，沉默CBX1抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

2.6過表達(dá)CBX1部分逆轉(zhuǎn)miR-141-3p對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組相比，從48 h起，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞活性顯著降低；與miR-141-3p+pcDNA組相比，miR-141-3p+pcDNA-CBX1組乳腺癌細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與miR-141-3p+pcDNA組相比，miR-141-3p+ pcDNA-CBX1組乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-141-3p組乳腺癌細(xì)胞中CBX1、CDK4、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與miR-141-3p+pcDNA組相比，miR-141-3p+ pcDNA-CBX1

組乳腺癌細(xì)胞中CBX1、CDK4、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖8、表6。可見，過表達(dá)CBX1可部分逆轉(zhuǎn)miR-141-3p對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖5 miR-141-3p與CBX1的互補(bǔ)序列信息

表4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

組別WT-CBX1MUT-CBX1miR-con組1.04±0.090.98±0.11miR-141-3p組0.44±0.061)1.04±0.13

與miR-con組比較:1)P<0.05

1～4：miR-con組、miR-141-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-141-3p組圖6 miR-141-3p調(diào)控CBX1蛋白表達(dá)

組別CBX1細(xì)胞活力(OD490)培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h培養(yǎng)72 h培養(yǎng)96 h空白對(duì)照組0.79±0.070.34±0.030.57±0.061.22±0.081.37±0.12si-con組0.75±0.060.34±0.040.54±0.051.17±0.091.34±0.11si-CBX1組0.25±0.051)0.32±0.030.41±0.051)0.69±0.051)0.82±0.081)組別CDK4CyclinD1MMP-2MMP-9細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè))細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè))空白對(duì)照組0.64±0.080.72±0.070.63±0.070.82±0.06131.54±11.6878.46±6.58si-con組0.61±0.070.70±0.060.59±0.060.79±0.07122.45±10.8174.64±6.84si-CBX1組0.36±0.041)0.31±0.041)0.34±0.051)0.35±0.051)62.45±5.681)27.35±4.281)

與si-con組相比較：1)P<0.05

圖7 si-CBX1對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1～4：miR-con組、miR-141-3p組、miR-141-3p+pcDNA組、miR-141-3p+pcDNA-CBX1組圖8 過表達(dá)CBX1部分逆轉(zhuǎn)miR-141-3p對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別CBX1細(xì)胞活力(OD490)培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h培養(yǎng)72 h培養(yǎng)96 hmiR-con組0.76±0.050.35±0.030.59±0.051.23±0.091.39±0.10miR-141-3p組0.41±0.041)0.33±0.030.42±0.041)0.65±0.081)0.77±0.081)miR-141-3p+pcDNA組0.35±0.040.34±0.040.43±0.030.67±0.060.74±0.07miR-141-3p+pcDNA-CBX1組0.59±0.052)0.36±0.040.52±0.052)0.89±0.072)1.12±0.092)組別CDK4CyclinD1MMP-2MMP-9細(xì)胞遷移數(shù)(個(gè))細(xì)胞侵襲數(shù)(個(gè))miR-con組0.67±0.080.76±0.070.64±0.070.78±0.06136.87±12.9482.64±6.37miR-141-3p組0.41±0.051)0.42±0.041)0.38±0.051)0.42±0.041)76.37±11.641)28.28±4.461)miR-141-3p+pcDNA組0.38±0.050.40±0.060.39±0.040.39±0.0372.25±10.6724.64±4.84miR-141-3p+pcDNA-CBX1組0.52±0.062)0.61±0.042)0.54±0.052)0.58±0.052)97.28±7.642)52.64±6.672)

與miR-con組比較：1)P<0.05；與miR-141-3p+pcDNA組比較：2)P<0.05

3 討 論

乳腺癌是威脅女性生命健康的一大惡性腫瘤，新型靶向治療可以選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，是當(dāng)前抗癌研究的熱點(diǎn)〔8〕。miRNA廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與乳腺癌的生物調(diào)控過程更是密切相關(guān)〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在化療耐藥的上皮性卵巢癌中顯著高表達(dá)，參與化學(xué)耐藥過程〔10〕。miR-141-3p在前列腺癌中上調(diào)表達(dá)，可通過抑制KLF9表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖〔11〕。LncRNA TP73-AS1調(diào)控miR-141-3p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔12〕。胃癌組織中miR-141低表達(dá)，miR-141抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制與下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)〔13〕。miR-141-3p可通過靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)并影響其下游途徑蛋白抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔14〕。miR-141-3p可抑制成纖維細(xì)胞的增殖和遷移〔15〕。miR-141-3p通過靶向GLI2抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究結(jié)果顯示，miR-141-3p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-141-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲。

CBX1是CBX家族成員之一，CBX1 mRNA高表達(dá)與乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存(RFS)惡化相關(guān)，還與化學(xué)抗性相關(guān)〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)CBX1在短暫性腦缺血發(fā)作和腦梗死患者中血清中高表達(dá)〔18〕。CBX1的過表達(dá)促進(jìn)了垂體瘤細(xì)胞增殖和遷移〔19〕。本研究結(jié)果顯示，CBX1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，沉默CBX1可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-141-3p靶向調(diào)控CBX1的表達(dá)。過表達(dá)CBX1能逆轉(zhuǎn)miR-141-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

細(xì)胞周期的失調(diào)是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的典型標(biāo)志之一，CyclinD1參與細(xì)胞周期進(jìn)展，它在乳腺癌組織中過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控、轉(zhuǎn)化和癌變〔20〕。CDK4抑制劑可聯(lián)合內(nèi)分泌治療晚期乳腺癌〔21〕。MMP-2及MMP-9在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)〔22〕。MMP-2和MMP-9活性增加可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔23〕。

綜上所述，過表達(dá)miR-141-3p和沉默CBX1能抑制CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲。