張英華 費(fèi)洪新 張曉杰，3 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；廣西科技大學(xué);3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病〔1,2〕。目前，AD發(fā)病機(jī)制尚不清楚，β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是致病因素之一〔3,4〕。近年來，一些學(xué)者認(rèn)為腦血管功能發(fā)生障礙會(huì)導(dǎo)致Aβ無法有效通過血腦屏障從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中清除，積聚在腦血管和腦實(shí)質(zhì)中〔5〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(TJ)是血腦屏障重要結(jié)構(gòu)，閉鎖小帶蛋白(ZO)-1是TJ重要成分〔6〕，上調(diào)ZO-1表達(dá)有助于保護(hù)血腦屏障，降低腦內(nèi)Aβ聚積，改善AD癥狀〔7〕。目前，關(guān)于AD的治療臨床上多采用西藥治療，如膽堿酯酶抑制劑等〔8,9〕、抗氧化劑〔10,11〕。但是西藥在治療疾病的同時(shí)有明顯副作用，由此研究副作用相對(duì)較小且綜合治療效果較好的中藥復(fù)方制劑是目前需研究的方向。本實(shí)驗(yàn)通過觀察健蕊康中水煎劑(JKD)對(duì)AD小鼠海馬Aβ和ZO-1的影響，進(jìn)一步探討JKD治療AD的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及儀器 動(dòng)物：清潔級(jí)3月齡淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，24只，體質(zhì)量(27±2)g，對(duì)照組小鼠選用同窩陰性雄鼠(8只)。小鼠均購買于南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院(SCXK(蘇)2015-0001)，動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。儀器：RM213型切片機(jī)(Leica公司)，BMJ-1B型組織包埋機(jī)(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)，HH-11420-BS型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器(北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司)，HT7700型透射電子顯微鏡(日立公司)等。

1.2藥物與試劑 藥物：JKD(商標(biāo)申請(qǐng)?zhí)枺?3678269)包括黃芪40 g(產(chǎn)品批號(hào)1712068S)，當(dāng)歸尾6 g(產(chǎn)品批號(hào)170501)，赤芍5 g(產(chǎn)品批號(hào)1704055S)，水紅花子20 g(產(chǎn)品批號(hào)175120)共71 g，購買于齊齊哈爾市中醫(yī)院，于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院經(jīng)過浸泡，煎煮，過濾，蒸發(fā)等制備成水煎劑，保存于4℃冰箱，灌胃前混勻加熱。試劑：鹽酸多奈哌齊(陜西方舟制藥公司，批號(hào)H20030583)；Aβ抗體(ab201060)和GAPDH抗體(ab9485)購于Abcam公司；抗體ZO-1(PB9234)和PBS(AR030)購于武漢博士德；改良檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(YB0303)購于上海鈺博生物科技等。

1.3模型分組及給藥 將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)法分為多奈哌齊組、JKD組、模型組。模型組和對(duì)照組小鼠給予0.3 ml生理鹽水灌胃，多奈哌齊組給予0.001 g/kg鹽酸多奈哌齊片灌胃，JKD組給予9.23 g/kg JKD灌胃。連續(xù)灌胃給藥35 d。

1.4學(xué)習(xí)能力檢測(cè) 參考文獻(xiàn)〔12〕檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力。圓形水池內(nèi)倒入自來水約高20 cm，再向水池內(nèi)倒入溫水泡好的奶粉攪拌均勻，使水池內(nèi)形成均勻白色背景，將平臺(tái)安裝于第4象限，使其低于水面下0.5～1.0 cm，水池內(nèi)水溫設(shè)定在(22±1)℃。前4 d為訓(xùn)練時(shí)間，將池劃分為4個(gè)象限，每天不同的隨機(jī)象限入水，每次訓(xùn)練60 s。如果小鼠在60 s內(nèi)站到平臺(tái)不足10 s，則需將其引到平臺(tái)上10 s。第5天檢測(cè)小鼠找到平臺(tái)時(shí)間為潛伏期，通過潛伏期長(zhǎng)短評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)能力。

1.5記憶能力檢測(cè) 小鼠前4 d訓(xùn)練同1.4，在第5天時(shí)撤去平臺(tái)，將小鼠在相同位置放入水池自由游泳60 s，記錄小鼠找到平臺(tái)撤去前隱藏位置的游泳距離，通過距離長(zhǎng)短評(píng)價(jià)小鼠記憶能力。

1.6學(xué)習(xí)記憶保持能力檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)同1.4，第5天撤去平臺(tái)，計(jì)算機(jī)記錄小鼠在目標(biāo)平臺(tái)交叉的次數(shù)(跨平臺(tái)次數(shù))，通過跨平臺(tái)次數(shù)多少評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶保持能力。

1.7透射電子顯微鏡觀察 行為學(xué)完成后，冰上迅速取小鼠海馬，依次戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，鋨酸固定，脫水，滲透等制成切片后觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞及TJ。

1.8免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè) 冰上迅速取小鼠腦組織，制成石蠟切片，按照試劑盒說明書操作，切片經(jīng)過脫蠟復(fù)水，微波修復(fù)，過氧化氫(H2O2)處理，封閉，一抗(4℃過夜)，二抗反應(yīng)，化學(xué)染色使用工作液，顯微鏡下觀察，流水沖洗10 min，復(fù)染，脫水封片后觀察，Image-ProPlus6.0軟件算出海馬Aβ和ZO-1平均光密度值(MOD)。

1.9RT-qPCR檢測(cè) 小鼠海馬組織80 mg，加入800 μl Trizol，按說明書進(jìn)行海馬總RNA抽提?？俁NA純度檢測(cè)后將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增。各引物的序列設(shè)計(jì)如下表：GAPDH(上游：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′；下游：3′-CCACAGGATTCCATACCCAA-5′)；Aβ(上游：5′-TGTGCGACAAGGTGCAGAAA-3′；下游：3′-ACAATGGCCACTTGCCGAT-5′)；ZO-1(上游：5′-AGCTGCCTCGAACCTCTACTCTAC-3′；下游：3′-GCCTGGTGGTGGAACTTGCTC-5′)。引物由上海生工有限公司合成。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計(jì)算海馬Aβ和ZO-1基因相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.14組學(xué)習(xí)記憶能力比較 與對(duì)照組比較，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)，游泳距離明顯增加，跨平臺(tái)次數(shù)明顯減少(均P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組潛伏期明顯縮短，游泳距離明顯減少，跨平臺(tái)次數(shù)明顯增加(均P<0.05)，見表1。

表1 JKD對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.24組TJ比較 對(duì)照組小鼠腦組織海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞及TJ處結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠腦組織海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)不豐富，細(xì)胞器變性，TJ模糊不清，表明模型組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞及TJ結(jié)構(gòu)異常；多奈哌齊組和JKD組與模型組相比較，腦組織海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞核固縮減輕，胞質(zhì)相對(duì)豐富，細(xì)胞器變性減少，TJ清晰可見。見圖1。

圖1 JKD對(duì)AD小鼠TJ的影響(透射電子顯微鏡，×62 000)

2.34組Aβ和ZO-1表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組Aβ MOD值明顯升高(P<0.05)，ZO-1 MOD值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組海馬Aβ MOD值均明顯降低(P<0.05)，ZO-1 MOD值明顯升高(P<0.05)，見表 2，見圖2，圖3。

2.44組Aβ 、ZO-1基因表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組AD海馬ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，海馬Aβ mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Aβ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)，見表3。

表2 4組Aβ 和ZO-1表達(dá)比較

圖2 JKD對(duì)AD小鼠海馬Aβ 表達(dá)的影響(IHC，×400)

圖3 JKD對(duì)AD小鼠ZO-1表達(dá)的影響(IHC，×400)

表3 4組Aβ mRNA和ZO-1 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

近年來，隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的深入研究，關(guān)于神經(jīng)血管單元的相關(guān)內(nèi)容逐漸與AD聯(lián)系起來。神經(jīng)血管單元是由神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞，血腦屏障等構(gòu)成〔13〕。AD的神經(jīng)血管假說認(rèn)為，神經(jīng)血管單元的任一成分異常都可能導(dǎo)致其功能障礙，而由ZO-1〔14,15〕和跨膜蛋白等構(gòu)成的TJ蛋白復(fù)合體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時(shí)，神經(jīng)血管單元的結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)發(fā)生異常。也有相關(guān)研究表明，當(dāng)ZO-1表達(dá)降低時(shí)，TJ結(jié)構(gòu)被破壞，血腦屏障通透性發(fā)生障礙，Aβ在腦內(nèi)積聚增多，導(dǎo)致AD的發(fā)生發(fā)展。因此上調(diào)ZO-1與降低Aβ和改善AD密切相關(guān)。

本研究結(jié)果說明JKD對(duì)AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用。JKD可通過抑制Aβ 水平，提高ZO-1水平，從而改善TJ結(jié)構(gòu)，恢復(fù)血腦屏障的基本功能，保護(hù)腦組織，這在AD治療中發(fā)揮積極作用。