譚錦萍，阮 征，陳羽中，黃小清

（1.華南理工大學(xué)，廣東廣州 510000；2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510410）

苯醚甲環(huán)唑又名噁醚唑，是一種具有高效、廣譜、低毒和內(nèi)吸傳導(dǎo)性強(qiáng)的三唑類(lèi)殺菌劑，對(duì)作物具有保護(hù)和治療作用，廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等農(nóng)作物上[1]。通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而達(dá)到殺菌目的，對(duì)蔬菜和瓜果的紋枯病、銹病、早疫病、葉斑病、黑星病、白粉病等具有較好的保護(hù)和治療作用。由于苯醚甲環(huán)唑具有持效期長(zhǎng)、與其他殺菌劑無(wú)交互抗性、不污染農(nóng)產(chǎn)品、不殺傷天敵的優(yōu)點(diǎn)[2-3]，加上農(nóng)民合理使用農(nóng)藥的水平有限、誤用和濫用情況嚴(yán)重，容易造成一些病蟲(chóng)害對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。在農(nóng)產(chǎn)品的日常監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)，265個(gè)蔬菜樣品中檢出苯醚甲環(huán)唑的陽(yáng)性樣品有50個(gè)，檢出率高達(dá)18.87%。可見(jiàn)，苯醚甲環(huán)唑在蔬菜種植中比較常用。

標(biāo)準(zhǔn)[4]規(guī)定，某些蔬菜苯醚甲環(huán)唑的最高殘留限量 （Maximum residue limit，MRL） 為 0.2 mg/kg。在實(shí)際檢測(cè)中，當(dāng)苯醚甲環(huán)唑的檢出值在限量值附近時(shí)，實(shí)驗(yàn)室出具的檢測(cè)結(jié)果直接關(guān)系到樣品是否合格的判定。因此，為確保結(jié)果的可信度，必須進(jìn)行不確定度的評(píng)估[5]。

1 材料與方法

1.1 材料儀器與試劑

蔬菜，購(gòu)于廣州某超市。

TSQ8000evo型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、EI離子源，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；BP221S型電子天平，美國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；2-16KL型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；HS501型數(shù)顯往復(fù)振蕩搖床，德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

苯醚甲環(huán)唑（100 μg/mL），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所提供；環(huán)氧七氯、乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher公司提供；QuEChERS分散固相萃取鹽包（內(nèi)含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g三水合二檸檬酸二鈉）、QuEChERS分散固相萃取凈化管（150 mg PSA和900 mg MgSO4）、陶瓷均質(zhì)器，美國(guó)Agilent公司提供。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：TR-PESTICIDEⅡ毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始柱溫40℃，保持1.5 min，以 25 min/℃升至90℃，保持1.5 min，以25 min/℃升至180℃，以5℃/min升至280℃，再以10 min/℃升至300℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度270℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流；載氣為高純氦氣，1.2 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度300℃，傳輸線溫度300℃，EI離子源70 eV。

定性、定量離子和碰撞能見(jiàn)表1。

表1 定性、定量離子和碰撞能

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取25 mg環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用正己烷溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取200 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，正己烷定容至10 mL，得到20 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。精確吸取苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確吸取 0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，準(zhǔn)確各加入50 μL的20 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液，用蔬菜的基質(zhì)空白溶液定容。以苯醚甲環(huán)唑濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值（C苯醚甲環(huán)唑/C內(nèi)標(biāo)）為橫坐標(biāo)、苯醚甲環(huán)唑峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積（A苯醚甲環(huán)唑/A內(nèi)標(biāo)） 的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 前處理方法

（1） 提取。均勻取樣并準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品10 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中， 加入20 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL，加入20 mL的乙腈，于組織搗碎機(jī)上提取2 min，置于-18℃冰箱中冷凍10 min后取出，加入QuEChERS萃取包、2粒均質(zhì)子，劇烈振搖1 min后，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min。

（2） 凈化。分取上清液 5 mL于QuEChERS凈化管中，劇烈振搖1 min后，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min，上清液過(guò)濾膜后，用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定。以保留時(shí)間和離子對(duì)豐度比定性，內(nèi)標(biāo)曲線法定量。

1.2.6 回收率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取各10.00 g空白蔬菜樣品6份，于50 mL離心管中，加入相同質(zhì)量濃度苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)，按1.2.5前處理方法同步進(jìn)行，測(cè)定苯醚甲環(huán)唑的含量，并對(duì)其回收率和精密度進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

從測(cè)定苯醚甲環(huán)唑的數(shù)學(xué)模型中，分析其不確定度的來(lái)源。就試驗(yàn)而言，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的計(jì)算公式為：

式中：X——樣品中苯醚甲環(huán)唑的含量，mg/kg；

C——由A樣/A內(nèi)標(biāo)從曲線中得出的試樣中苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量濃度，mg/L；

V——提取液體積，mL；

m——稱(chēng)量質(zhì)量，g；

frec——加標(biāo)試驗(yàn)的回收率，%；

根據(jù)JJF 1059—1999[6]，由相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

2.2 試驗(yàn)結(jié)果

取6個(gè)加標(biāo)的蔬菜樣品，按照1.2.5的處理方法對(duì)蔬菜樣品中苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行平行6次的試驗(yàn)，對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定結(jié)果

由表1可以計(jì)算出本次試驗(yàn)測(cè)定的苯醚甲環(huán)唑含量為：

3 不確定度評(píng)定

3.1 不確定度的來(lái)源分析

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法原理，被測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入的內(nèi)標(biāo)物相同，即內(nèi)標(biāo)物的濃度可約除，因此無(wú)需考慮內(nèi)標(biāo)物純度引起的不確定度，只考慮內(nèi)標(biāo)物加入的體積?？v觀整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，對(duì)蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘量結(jié)果有影響的不確定度分量來(lái)源有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品、樣品前處理過(guò)程、儀器分析過(guò)程等。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的不確定度Urel(標(biāo))

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度引起的不確定度Urel(標(biāo)p)

苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，根據(jù)證書(shū)信息，苯醚甲環(huán)唑的標(biāo)準(zhǔn)值為100 μg/mL，擴(kuò)展不確定度為 0.19 μg/mL。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引起的不確定度Urel(標(biāo)v)

試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制過(guò)程使用了10 mL的容量瓶（A級(jí)），標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程使用了100 μL和1 mL移液器，按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]和JJG 646—2006《移液器》[8]檢定規(guī)程，玻璃器和移液器均有相應(yīng)的最大允許誤差，其不確定來(lái)源包括以下2個(gè)方面。

（1）容量瓶、移液器本身的不確定度。檢定證書(shū)指出10 mL容量瓶（A級(jí)）的最大允差為±0.020 mL，100 μL移液器的最大允差為±2.0%，1 mL移液器最大允差為±1.0%，由量具允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

（2）環(huán)境溫度引起的不確定度。實(shí)驗(yàn)室的溫度一般控制在20±5℃，20℃時(shí)乙腈的膨脹系數(shù)是1.37×10-3℃，由環(huán)境溫度引起的相對(duì)不確定度公式為：

根據(jù)各分量合成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度為：

玻璃器具和移液器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表2。

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)校正曲線擬合的不確定度Urel(標(biāo)w)

試驗(yàn)對(duì)6個(gè)不同濃度的苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)標(biāo)校正曲線見(jiàn)表3。

表2 玻璃器具和移液器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表3 內(nèi)標(biāo)校正曲線

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯醚甲環(huán)唑與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，苯醚甲環(huán)唑與內(nèi)標(biāo)物豐度比值為縱坐標(biāo)，得到的回歸方程為Y=4.618X-0.193 1，R2=0.999 3。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物質(zhì)信號(hào)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差為：

對(duì)苯醚甲環(huán)唑?yàn)殛幮缘氖卟藰悠愤M(jìn)行5次的添加回收試驗(yàn)（添加量為0.2 mg/kg）。

樣品測(cè)定結(jié)果（n=5） 見(jiàn)表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=5）

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：S——標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物質(zhì)信號(hào)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，0.1；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，4.618；

P——試驗(yàn)次數(shù)，5；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù)，6；

C0——樣品中苯醚甲環(huán)唑的實(shí)際測(cè)定濃度，0.105 2；

cˉ——各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值，0.64；

Sn——所有校準(zhǔn)溶液濃度的離均差平方和。

則曲線擬合的引入的相對(duì)不確定度為Urel(標(biāo)w)=U(std)/1.052=0.084/1.052=0.079 8.

綜上分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)所引入的不確定度來(lái)源，計(jì)算由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為：

3.3 儀器重復(fù)測(cè)量引入的不確定度Urel(儀)

儀器引入的不確定度是由儀器對(duì)被測(cè)組分的響應(yīng)值（峰面積）的重復(fù)性差異引起的，按A本類(lèi)評(píng)定，可通過(guò)重復(fù)進(jìn)樣來(lái)計(jì)算。通過(guò)將同一樣品溶液進(jìn)行連續(xù)6次重復(fù)進(jìn)樣，得到的重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果。

重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[6]，在測(cè)定次數(shù)少的情況下，可采用極差法對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)定，查表可得，當(dāng)n=6，C=2.53。即由重復(fù)性進(jìn)樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 樣品前處理中引起的不確定度Urel(樣)

樣品處理過(guò)程不確定度的主要來(lái)源：一是樣品使用的稱(chēng)量天平引起的不確定度；二是樣品提取、凈化、定容等過(guò)程中所使用的玻璃量器所引起的不確定度。

樣品用百分之一天平進(jìn)行稱(chēng)量，其校準(zhǔn)允差為±0.01g，試驗(yàn)稱(chēng)取樣品量為10 g，k按均勻分布計(jì)算，K??；樣品凈化、定容過(guò)程中使用的是20 mL的移液管。

天平和玻璃量器引起的不確定度見(jiàn)表6。

由表6可知，樣品前處理過(guò)程所引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為：

3.5 結(jié)果計(jì)算過(guò)程引入的不確定度Urel(frec)

回收率是結(jié)果計(jì)算中的一個(gè)重要的不確定度來(lái)源因子。取低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6次試驗(yàn)，按照2.2.5步驟進(jìn)行處理上機(jī)。對(duì)18次的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行添加回收率計(jì)算。

表6 天平和玻璃量器引起的不確定度

回收率結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7。

表7 回收率結(jié)果統(tǒng)計(jì)

回收率按A類(lèi)不確定度進(jìn)行評(píng)定計(jì)算，當(dāng)n=18，

則，由回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 不確定度的合成及擴(kuò)展

4.1 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的合成

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見(jiàn)表8。

表8 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

苯醚甲環(huán)唑的相對(duì)合成不確定度為：

折算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

取置信水平為95%，k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U(C)=u(C)×k=0.017×2=0.034。因此，樣品中苯醚甲環(huán)唑的殘留量表示為（0.2±0.0.034） mg/kg（k=2）。

5 結(jié)論

以苯醚甲環(huán)唑?yàn)橹饕芯繉?duì)象，對(duì)蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的不確定度評(píng)估進(jìn)行了論述。當(dāng)取樣量為10 g，k=2（95%置信度） 測(cè)得的蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的含量為（0.2±0.034） mg/kg。表明整體方法的準(zhǔn)確性較好，可用于蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的測(cè)定和不確定評(píng)估。