鐘雷響 徐少華

摘? 要：本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定烏雞雞肉中羥基甲硝唑和甲硝唑含量的方法。雞肉樣品經(jīng)過乙腈水溶液提取，離心取用上清液再經(jīng)過PRIME HLB固相萃取柱凈化、氮吹、甲醇水溶液定容以及0.22 μm水相濾膜過濾，隨后用液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法檢測硝基咪唑。結(jié)果顯示：在線性范圍0.1 μg/L～500 μg/L內(nèi)，硝基咪唑類藥物線性關(guān)系良好，甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r=0.997，羥基甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r=0.999 3。在1.0 μg/kg、? ? ? ? 2.0 μg/kg和10 μg/kg三個(gè)水平添加回收試驗(yàn)條件下，甲硝唑的回收率為80%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.45%～11.0%;羥基甲硝唑的回收率為74.0%～96.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%～8.33%?？纱_定的方法檢出限甲硝唑?yàn)?.35 μg/kg，羥基甲硝唑?yàn)?.38 μg/kg。該方法具有靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可滿足雞肉中痕量元素的檢測。

關(guān)鍵詞：液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法;硝基咪唑類藥物;烏雞;檢測方法

硝基咪唑類藥物是一種抗菌藥物，在預(yù)防和治療家禽的組織滴蟲病和寄生蟲病、牛滴蟲病、豬出血性腸炎、魚寄生蟲感染和蜂微孢子蟲病等疾病上有很大的作用。此類藥物進(jìn)入動(dòng)物易感的細(xì)胞后，在無氧或少氧環(huán)境和較低的氧化還原電位下，其硝基會被電子專遞蛋白還原成具有細(xì)胞毒性作用的氨基，抑制微生物細(xì)胞合成DNA，并降解DNA，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，發(fā)揮其迅速殺滅厭氧菌和有效控制細(xì)菌感染的作用[1]。體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)，硝基咪唑類藥物有遺傳毒性、致畸和可疑致癌的作用[2-3]。為了防止甲硝唑殘留傷害人類健康，不少國家都制定了相關(guān)規(guī)定，歐盟和加拿大等地區(qū)或國家都禁止在食源性動(dòng)物生產(chǎn)中使用甲硝唑。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2002年頒布的227號公告《杜絕禁用獸藥的濫用》中規(guī)定不準(zhǔn)以促進(jìn)動(dòng)物生長為目的在食品動(dòng)物的生產(chǎn)中使用甲硝唑及其鹽和酯。本試驗(yàn)選取烏雞為試驗(yàn)動(dòng)物，一方面因?yàn)闉蹼u是廣東省傳統(tǒng)的地方名菜烏雞煲湯的主材，消費(fèi)量大;另一方面由于烏雞自身的藥物代謝困難，容易造成藥物在體內(nèi)殘留蓄積。為了保證消費(fèi)者能在市場上購買到安全的烏雞，準(zhǔn)確測定烏雞肉產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的含量十分重要。

1? 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）;Oasis? PRIME HLB（6 cc 200 mg）固相萃取小柱（美國Waters公司）、0.22 μm有機(jī)相濾膜（上海安譜公司）、電子天平（感量0.01 g、感量0.000 1 g，瑞士梅特勒公司）;高速離心機(jī)（美國sigma公司）;固相萃取裝置;超聲波清洗儀;可控溫氮吹濃縮儀;渦旋振蕩器。

1.2 試劑

甲硝唑和羥基甲硝唑（MNZOH）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99%，美國DR公司），水符合GB/T 6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級水標(biāo)準(zhǔn);甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）和甲酸（HCOOH）均為色譜純。

1.3 試劑配制

乙腈水溶液由90%乙腈和10%水配制而成，甲醇水溶液由10%甲醇水和0.1%甲酸配制而成。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均用甲醇配制成1.00 mg/mL，在-18 ℃條件下于棕色瓶中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)藥物的靈敏度和儀器線性范圍，用甲醇水溶液配成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 烏雞

烏雞購自廣東省深圳市各大農(nóng)貿(mào)市場和商場超市。試驗(yàn)用的雞肉樣品取自烏雞胸部和腿部的肌肉，經(jīng)碾磨機(jī)粉碎至均勻肉泥狀，裝瓶保存于-18 ℃。

2? 試驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件

（a）色譜柱：亞乙基橋雜化顆粒（BEH） C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）;（b）流速：0.3 mL/min;（c）柱溫：40 ℃;（d）進(jìn)樣量：5.0 μL;（e）流動(dòng)相及梯度洗脫程序見表1。

2.1.2 質(zhì)譜參考條件

（a）離子源：電噴霧離子源（ESI）;（b）掃描方式：正離子掃描/負(fù)離子掃描;（c）檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（Multi Reaction Monitoring Mode，MRM）;（d）電噴霧電壓（IS）：5 500 V/-4 500 V;（e）離子源溫度（TEM）：550 ℃;（f）氣簾氣（CUR）：35 psi;（g）碰撞氣壓力（CAD）：8 psi;? ? （h）噴霧氣（GS1）：55 psi;（i）輔助加熱氣（GS2）：55 psi;（j）藥物保留時(shí)間、定性定量離子對及去簇電壓和碰撞電壓見表2。

2.2 前處理步驟

早期研究將樣品的pH調(diào)節(jié)為3，用蛋白酶過夜酶解提取與組織蛋白結(jié)合的殘留物[4]，但近期研究表明沒必要進(jìn)行酶解[5-6]。因此，本試驗(yàn)用90%的乙腈水溶液作為提取劑，直接提取殘留藥物。

2.2.1 提取

稱取試樣2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管內(nèi)，加乙腈水溶液5 mL，震蕩搖勻30 s，于超聲波清洗儀超聲5 min，用高速離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心? ? ? 10 min，轉(zhuǎn)移上清液于15 mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液混勻之后再次用高速離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。

2.2.2 凈化

于上述離心后提取液中移取5 mL上清液，直接過固相萃取柱，保持1 s/滴的速度。用玻璃小管收集全部流出液，準(zhǔn)確移出2 mL到15 mL帶刻度的小管內(nèi)。流出液在40 ℃水浴下氮?dú)獯抵辽儆?.5 mL。殘留液用甲醇水溶液定容至1.00 mL，過? 0.22 μm水相濾膜，待上機(jī)測定。

3? 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 高效液相條件確定

為尋找分離度好、靈敏度高且峰形尖銳的液相條件，參考相關(guān)文獻(xiàn)及檢測標(biāo)準(zhǔn)，選用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，? ?3.0 mm×100 mm）色譜柱，柱溫為40 ℃，采用甲酸水和甲醇作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣流速為0.30 ng/mL時(shí)，硝基咪唑相應(yīng)強(qiáng)度1.5×105，背景基線非常低，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，可有效進(jìn)行硝基咪唑的定性定量檢測（圖1和圖2）。

3.2 前處理方法的確定

由于雞的肌肉呈現(xiàn)纖維狀，所以需要用本方法先對肌肉進(jìn)行粉碎處理。乙腈沉淀蛋白效果較好，與水性基質(zhì)互溶，是提取組織中硝基咪唑類藥物的常用溶劑之一。乙腈用于提取禽肉類樣品，回收率在79%～93%[7-8]，故本試驗(yàn)選用乙腈水溶液作為提取劑。樣品加入提取劑后經(jīng)過超聲輔助提取，可以更充分提取烏雞肌肉中的硝基咪唑類藥物。再經(jīng)過高速離心，使提取劑中的殘?jiān)恋?，其中試劑也起到了稀釋的作用，有利于降低其他成分對檢測儀器的信號干擾，并且可提高儀器檢測的靈敏度。

3.3 線性范圍，檢出限檢測結(jié)果

按照方法條件設(shè)置參數(shù)，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液（0.10 μg/L、? ?2.00 μg/L、20.0 μg/L、100 μg/L和500 μg/L），待儀器穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測定，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r=0.997，羥基甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r=0.999 3。

以烏雞肌肉樣品為基質(zhì)，添加濃度為1.0 μg/kg，按照上述方法進(jìn)行前處理和測定，平行樣品（n）為7個(gè)，對于甲硝唑，根據(jù)各樣品檢測值（0.80 μg/kg、0.88 μg/kg、? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?1.06 μg/kg、0.84 μg/kg、? ? 0.88 μg/kg、0.80 μg/kg和? ?1.02 μg/kg）計(jì)算出平均值（x）（0.897 μg/kg）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（Sb）（0.103 6），當(dāng)被分析物的回收率在70%～120%時(shí)，可計(jì)算檢出限為0.35 μg/kg;對于羥基甲硝唑，根據(jù)各樣品檢測值（0.88 μg/kg、0.84 μg/kg、0.74 μg/kg、0.74 μg/kg、0.88 μg/kg、0.88 μg/kg和1.06 μg/kg）計(jì)算出平均值（x）（0.860 μg/kg）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（Sb）（0.108 4），當(dāng)被分析物的回收率介于70%～120%時(shí)，可計(jì)算檢出限為0.38 μg/kg。計(jì)算公式如下：

3.4 方法精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果

以烏雞肌肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行六組平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測試，甲硝唑加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為80%～106%、90%～109%和91.2～96.6%，羥基甲硝唑加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為74%～88%、78%～93%和86.0～96.6%。甲硝唑及硝基甲硝唑的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

4? 討論

本試驗(yàn)討論建立了測定烏雞肌肉中硝基咪唑類藥物含量的高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法通過乙腈水溶液提取、離心和氮吹等處理步驟，最終建立了甲硝唑和羥基甲硝唑的方法檢出限 分別達(dá)到了0.35 μg/kg和0.38 μg/kg，線性范圍為0.1 μg/L～500 μg/L。烏雞肌肉樣品在1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和? ? ? ? ? ? ?10.0 μg/kg三個(gè)水平添加回收試驗(yàn)條件下，甲硝唑回收率為80%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.45%～11.00%;羥基甲硝唑回收率為74.0%～96.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%～8.33%。該方法具有分析過程簡單、準(zhǔn)確精密和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能滿足烏雞肌肉中硝基咪唑類藥物的快速篩查和檢測定量。