曾勇波 馬海明
摘? 要:本研究以寧鄉(xiāng)豬為研究對象,用測序方法發(fā)現(xiàn)一個A→G類型SNP,采用PCR-RFLP-Pst I進(jìn)行分型。結(jié)果表明:寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因A/G位點的AA型、AG型和GG型頻率分別為0.08、0.73和0.19,A基因和G基因頻率分別為0.45和0.55,這表明寧鄉(xiāng)豬該位點基因型基本處于雜合狀態(tài)。本研究為寧鄉(xiāng)豬的保種選育積累了有益的資料。
關(guān)鍵詞:豬;GADD45G基因;PCR-RFLP-Pst I
哺乳動物的生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45(Growth Arrest and DNA Damage Inducible Gamma 45,GADD45G)是一類重要的信號換能器,并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能。GADD45G基因在人類基因去甲基化方面研究較多,但該基因在豬上的研究極少。鑒于國內(nèi)外對豬GADD45G基因的研究甚少,我們開展了寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因分子遺傳特性研究,以便為揭示GADD45G基因?qū)ωi肉質(zhì)性狀的研究奠定基礎(chǔ)。
1? 材料與方法
1.1 樣品采集
選擇325頭大白豬和67頭寧鄉(xiāng)豬,采集豬耳小塊組織樣本,隨后提取DNA。
1.2 PCR擴(kuò)增條件
正向引物為5'-AAA CTT GCT GCT TGC G-3';反向引物為5'-GGA TGG AGG CGA CAC T-3'。
1.2.1 PCR反應(yīng)體系(總體積20 μL)
10×Buffer 2 μL,2 mmol/L dNTPs 1.6 μL,20 mmol/L MgCl2 1.6 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.4 μL,DNA模板(100 ng/μL)1 μL,上下游引物? ? ? ?(10 pmol/μL)各0.4 μL,雙蒸蒸餾水? (dd H2O) 12.6 μL。
1.2.2 PCR反應(yīng)程序
94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,共35個循環(huán);72 ℃后延伸8 min,最后4 ℃保存。
1.3 PCR產(chǎn)物Pst I酶切
在10 μL PCR產(chǎn)物中加入0.8 μL 10×內(nèi)切酶緩沖液、0.2 μL限制性內(nèi)切酶和1 μL雙蒸蒸餾水,總體積為? ? ? 12 μL,37 ℃消化4 h~10 h。
A/G位點用2%瓊脂糖凝膠電泳分析,5 V/cm電壓電泳0.5 h(圖1),擴(kuò)增片斷為第1外顯子至第2外顯子,共804 bp,為PCR-RFLP-Pst I分子標(biāo)記。
2? 結(jié)果與分析
在擴(kuò)增的804 bp的片斷中,GADD45G基因的Pst I的酶切位點A/G位點存在3種基因型:AA型(804 bp)、AG型(164 bp+640 bp+804 bp)和GG型(164 bp+640 bp)。對GADD45G基因A/G位點的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行檢測,PCR-RFLP-Pst I多態(tài)性的分布情況如表1所示,寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因A/G位點均存在AA基因型、GG基因型以及AG基因型,AG基因型頻率較高,基因頻率分別為0.08、0.73和0.19;A基因和G基因的頻率分別為0.45和0.55,A/G位點的基因型大部分處于雜合狀態(tài)。
3 討論與結(jié)論
經(jīng)卡方檢驗,寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因A/G位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài),表明本研究結(jié)果可靠。本研究為寧鄉(xiāng)豬的保種和系統(tǒng)選育奠定了理論基礎(chǔ)。