宋素珍，李佳琳，曹娜娜，趙夢曉，楊賢慶，沈 琳，李穎暢

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 540641；3.大連東霖食品股份有限公司，遼寧大連 116101）

0 引言

阿根廷魷魚具有很高的營養(yǎng)價值，屬于低脂肪高蛋白海產(chǎn)品，是我國最重要的經(jīng)濟類海產(chǎn)品之一。近年來魷魚等海產(chǎn)品內(nèi)含有甲醛的問題一直受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。研究證明魷魚及其制品中含有較高含量的甲醛（FA）［1-3］。FA能夠與細胞親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷，進而引發(fā)各種癌癥；甲醛還可與氨基酸殘基反應(yīng)，促進蛋白質(zhì)鏈分子間和分子內(nèi)連接形成共價交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)變性，影響魷魚的品質(zhì)［4］。魷魚內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生途徑包括：生物途徑和非酶途徑［5］。在低溫貯藏期間，酶學(xué)途徑是水產(chǎn)品產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛的主要途徑［6］。國外研究者對鱈魚等海產(chǎn)品中的氧化三甲胺脫甲基酶（TMAOase）進行初步研究，TMAOase主要集中在內(nèi)臟組織［7-8］。

低溫保鮮是水產(chǎn)品保鮮中最為常見的一種方法［9］，但是低溫貯藏過程中仍會有甲醛產(chǎn)生。Jinhwan等［10］研究了貯藏條件對鱈魚甲醛含量的變化；韓冬嬌等［11］研究了不同貯藏溫度下南白美對蝦中甲醛的含量；苗林林等［12］研究了梭子蟹貯藏和加工過程中內(nèi)源性甲醛含量的變化，但是不同貯藏溫度下，魷魚中甲醛變化規(guī)律以及與氧化三甲胺脫甲基酶（TMAOase）活性的關(guān)系研究鮮見報道。

本文通過測定不同貯藏溫度下阿根廷魷魚體內(nèi)FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase活性、肌原纖維蛋白溶解性、菌落總數(shù)，探討了不同溫度對阿根廷魷魚中甲醛的影響及酶催化途徑對魷魚甲醛的積累作用，旨在為酶學(xué)途徑控制海產(chǎn)品中甲醛含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿根廷魷魚（錦州市林西路水產(chǎn)市場）；曲拉通X-100（TritonX-100，北京化學(xué)試劑公司）；甲醛溶液（分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司）；甲苯（分析純，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，DIKMA公司）；苦味酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；甲醛標準溶液（10.4 mg/mL，國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所）；三羥甲基氨基甲烷（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TMAO標準品（國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度儀（島津儀器有限公司）；THERMO X1R冷凍高速離心機（美國Thermo公司）；Agilent GC7890氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；MS105DU電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；雷磁pHS-C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 貯藏條件

將阿根廷魷魚分別在4 ℃，0 ℃，-20 ℃下貯藏，測定樣品FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase酶活、肌原纖維蛋白溶解度、菌落總數(shù)，根據(jù)不同溫度的貯藏期，4 ℃和0 ℃貯藏18 d，每隔2 d取樣測定，-20 ℃下分別在0、9、18、27、36、45、54 d取樣測定。各指標測定均做三個重復(fù)試驗，每個試驗平行測定兩次。

1.3.2 樣品處理

根據(jù)朱軍莉等［13］的方法略作修改，將阿根廷魷魚清洗、去皮、取胴體，取2.00 g絞碎的魚肉，加50 mL超純水，震蕩混勻后浸泡10 min，加入20 mL 10%三氯乙酸混勻，冰浴超聲30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 4.0，然后定容至100 mL，4 ℃冷藏待用。

1.3.3 甲醛（FA）的測定

根據(jù)Benjakul等［14］的方法測定FA含量，取1 mL上清液，加蒸餾水至5mL，加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均勻，60 ℃水浴10 min，取出冷卻，以空白為參比，于波長413 nm處測吸光度值。公式如下：

式中 A ——樣品管相當(dāng)于標準甲醛的量，μg；

m ——樣品質(zhì)量；

v1——TCA萃取總體積；

v2——樣品測定萃取體積；

X ——甲醛的含量，mg/kg。

1.3.4 二甲胺的測定

根據(jù)賈佳［15］等的方法測定二甲胺（DMA）含量，取2 mL上清液，加入2 mL 65%KOH溶液，定容至5 mL，加入2 mL對甲苯磺酰氯-甲苯溶液，60 ℃水浴加熱1 h，取出冰浴冷卻，漩渦振蕩3 min，進行GC-FID分析。

1.3.5 三甲胺的測定

根據(jù)賈佳的方法略作修改，取4mL上清液，依次加入l mL 10% FA、5 mL甲苯、3 mL 25% KOH，30 ℃水浴30 min，震蕩3min，將甲苯層用0.2 g無水硫酸鈉吸水，吸取2 mL無水甲苯層與2 mL苦味酸混合，以空白為參比，在410 nm處測定吸光值。

1.3.6 氧化三甲胺的測定

取4 mL反應(yīng)液加入1%三氯化鈦溶液0.50 mL，振蕩混勻于80 ℃水浴90 s，冷水冷卻。其他步驟同TMA測定步驟相同。氧化三甲胺（TMAO）計算公式如下：

式中 A0——樣品中氧化三甲胺的含量，mg/kg；

A1—— 經(jīng)三氯化鈦溶液還原后的三甲胺含量，mg/kg；

A2——樣品中三甲胺的含量，mg/kg；

79.11 ——氧化三甲胺的相對分子質(zhì)量；

59.11——三甲胺的相對分子質(zhì)量。

1.3.7 氧化三甲胺脫甲基酶活性的測定

參考金洋等［16］的方法提取粗酶，稱取15 g肝臟，以l：3的比例加入抽提液（0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-乙酸），混合勻漿100 s，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）除去雜蛋白，用1 mol/L HCl將其酸化，調(diào)節(jié)pH至4.5后，離心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），除去雜蛋白；再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，繼續(xù)離心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），取上清液，即為酸化的粗酶液。

參考Kimura等［17］的方法測定氧化三甲胺脫甲基酶活性。反應(yīng)液中含有20 mmol/L TMAO、2 mmol/L半胱氨酸、2 mmol/L抗壞血酸、0.2 mmol/L FeCl2和20 mmol/L Tris-乙酸（pH 7.0），加入酶液，25 ℃反應(yīng)15 min后加入10% TCA 終止反應(yīng)，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取1 mL上清液測定甲醛含量。在相同條件下，分別以不加酶液的反應(yīng)液和不加反應(yīng)液的酶液作為陰性對照。

1.3.8 肌原纖維蛋白溶液的提取

參考Bertram［18］方法略作修改，將阿根廷魷魚流水解凍，去皮，取酮體肉，加3倍體積A液（0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1倍體積B液（1% Triton X-100、0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.5）均質(zhì)（10 000 r/min，30 s，至少6次），紗布過濾（除去結(jié)締組織），離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），去上清液，沉淀用4倍體積A液浸提，重復(fù)浸提4次，所得沉淀即為肌原纖維蛋白，并測定其蛋白質(zhì)含量。所有操作均在4 ℃條件下進行，備用。

1.3.9 肌原纖維蛋白溶解度的測定

參考Benjakul［19］的方法略作改進，取5 mL蛋白濃度為5 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液于7 mL離心管中，離心（4℃，3 000 r/min，10 min），立即取上清液1 mL，并加入4 mL雙縮脲試劑混勻，在25 ℃中靜置30 min，以空白為參比，540 nm下測吸光度，重復(fù)3次，肌原纖維蛋白的溶解程度用溶解性（PS）來表示，公式如下：

式中 C1——離心后上清液中的蛋白質(zhì)濃度；

C2——離心前的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.10 菌落總數(shù)的測定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法測定［20］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗7次重復(fù)3次，用SPASS19.0對進行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下FA含量的變化

圖1是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中FA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃魷魚的FA初始值為6.68 mg/kg，隨著貯藏時間的增加FA含量顯著增加（P＜0.05），到貯藏末期其含量分別達到了16.54、13.48和12.69 mg/kg。

在低溫貯藏過程中甲醛的產(chǎn)生主要是由于魷魚體內(nèi)氧化三甲胺脫甲基酶的催化作用。4 ℃和0 ℃貯藏后期迅速增加可能是由于魷魚組織受到魷魚內(nèi)部器官的污染，使肌肉組織充分與氧化三甲胺酶接觸導(dǎo)致甲醛增加；在-20 ℃的冷凍貯藏狀態(tài)下，氧化三甲胺脫甲基酶仍有活性，導(dǎo)致FA含量增加；相同貯藏時間內(nèi)，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，各溫度之間差異顯著（P＜0.05），這可能是由于4 ℃條件下酶的活性較強，同時還有微生物的腐敗作用；貯藏溫度越低，甲醛含量就越低，因此低溫貯藏有利于控制魷魚中的甲醛含量。朱仁義等［21］對室溫0 ℃，4 ℃和-20 ℃貯藏條件下的烏賊內(nèi)源性甲醛含量進行研究，發(fā)現(xiàn)了相似的變化。

2.2 不同貯藏溫度下DMA含量的變化

二甲胺是海產(chǎn)品氧化三甲胺分解產(chǎn)物之一，是魚肉的腐敗指標之一，也是魚肉腥臭味的來源。研究表明，氧化三甲胺在氧化三甲胺脫甲基酶的作用下分解為甲醛和二甲胺［22-23］。圖2是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中DMA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃魷魚的DMA初始值在100 mg/kg左右。隨著貯藏時間的增加，DMA含量顯著增加（P＜0.05），且與貯藏時間顯著相關(guān)（R4℃=0.981，R0℃=0.996，R-20℃=0.990），各溫度之間DMA含量差異顯著。到貯藏末期4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏條件下DMA含量分別達到初期的3.6倍、3.4倍和2.1倍，相同貯藏時間內(nèi)，4 ℃DMA含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，溫度低時酶活性部分被抑制，二甲胺含量相對較低。

2.3 不同貯藏溫度下TMA含量的變化

三甲胺是氧化三甲胺的還原產(chǎn)物，具有腥臭味，因此也可用來判斷水產(chǎn)品是否新鮮。鱈魚等深海魚類體內(nèi)含有氧化三甲胺，當(dāng)魚類死后，在微生物和酶的作用下，氧化三甲胺被還原為三甲胺，隨著魚體新鮮度的下降，三甲胺含量逐漸增加［24］。圖3是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中TMA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃和0 ℃魷魚的TMA初始值為35.29 mg/kg，隨著貯藏時間的增加TMA含量顯著增加（P＜0.05），到貯藏末期其含量分別達到了270.58和218.3 mg/kg，在冷藏初期，魷魚新鮮，品質(zhì)良好，TMA含量低，到冷藏后期魷魚開始腐敗，TMAO在酶和微生物作用下，魚腥味產(chǎn)生，TMA含量增加；-20 ℃下TMA由初始的35.29 mg/kg增長到190.2 mg/kg，由于低溫魚體內(nèi)代謝緩慢，因此三甲胺增長緩慢；相同貯藏時間內(nèi)，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低。

2.4 不同貯藏溫度下TMAO含量的變化

TMAO是海洋生物中的天然滲透劑和重要的非蛋白氮、水產(chǎn)品的鮮味物質(zhì)，也是產(chǎn)生三甲胺（TMA）、二甲胺（DMA）和甲醛（FA）的主要前體物質(zhì)［25］。圖4是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中TMAO含量的變化。結(jié)果顯示，4，0 ℃和-20 ℃貯藏下TMAO含量均呈現(xiàn)下降趨勢，不同溫度下貯藏時間對TMAO含量變化的影響差異顯著（P＜0.05）；相同貯藏時間內(nèi)，4 ℃氧化三甲胺含量最低，0 ℃次之，-20 ℃最高，可見溫度越低氧化三甲胺分解越慢。

2.5 不同溫度貯藏下TMAOase活性的變化

TMAOase廣泛分布于海產(chǎn)動物組織中，是海產(chǎn)品中TMAO產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛的主要酶類［26］。圖5是在4，0，和-20 ℃貯藏下阿根廷魷魚肝臟中TMAOase活性的變化，結(jié)果顯示，4，0和-20 ℃貯藏下魷魚的TMAOase的初始活性在1.38 U/g；4和0 ℃貯藏條件下，氧化三甲胺脫甲基酶活性顯著（P＜0.05）升高，后趨于平緩，這可能是由于貯藏時間的延長TMAOase發(fā)生變性從而導(dǎo)致酶活性降低；-20 ℃時隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)先升高（P＜0.05）后降低的趨勢（P＜0.05），這可能是由于TMAOase主要集中在溶酶體膜上［27］，-20 ℃貯藏后期由于冰晶變大導(dǎo)致溶酶體膜被破壞，從而導(dǎo)致TMAOase的活性降低。

2.6 不同貯藏溫度下肌原纖維蛋白溶解度的變化

溶解性是反映蛋白變性的一個重要指標，反映魷魚產(chǎn)品的品質(zhì)［28］。圖6是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中肌原纖維蛋白溶解性變化。結(jié)果顯示，3組蛋白的初始溶解度為72.9%，隨著貯藏時間的延長，各溫度下蛋白的溶解性呈下降趨勢，3組貯藏條件分別在第18、54 d時溶解性分別達到50.01%、53.17%、54.62%；相同貯藏時間內(nèi)4 ℃下降最多，依次是0，-20 ℃，各溫度之間存在顯著差異（P＜0.05），溫度越低，蛋白變性越慢，溶解性越好；這和甲醛的生成量相關(guān)，F(xiàn)A與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的官能團發(fā)生反應(yīng)，形成分子內(nèi)和分子間的亞甲基橋，使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)生聚集，聚集物增加，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)溶解度的下降。

2.7 不同貯藏溫度下魷魚菌落總數(shù)的變化

海產(chǎn)品在貯藏過程中極易受到微生物感染，菌落總數(shù)可反映海產(chǎn)品的腐敗程度，同時魷魚等海產(chǎn)品在微生物的作用下也可產(chǎn)生少量甲醛［29］。圖7是阿根廷魷魚在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的變化。結(jié)果顯示，貯藏初期阿根廷魷魚的菌落總數(shù)均小于4 lg（CFU/g），均處于1級鮮度。隨著貯藏時間的增加，各溫度下的菌落總數(shù)總體呈上升趨勢；4 ℃，0 ℃貯藏至15 d分別達到6.4、6.03 lg（CFU/g），魷魚已經(jīng)超過了食用價值。相同貯藏時間內(nèi)，-20 ℃的菌落總數(shù)低于4 ℃，0 ℃。菌落總數(shù)與FA、DMA、TMA變化趨勢一致，主要是由于微生物能利用TMAO，產(chǎn)生TMA，菌落總數(shù)的增加導(dǎo)致魚肉組織迅速軟化和水解，加速了魚肉腐敗，而這一過程又促進了魷魚組織中的TMAOase釋放與激活，使魚肉組織中的DMA和FA含量迅速增加［30］。

3 結(jié)語

阿根廷魷魚在4 ℃、0 ℃和-20 ℃貯藏下，隨貯藏時間的延長菌落總數(shù)、甲醛、二甲胺、三甲胺顯著性增加（P＜0.05），氧化三甲胺、溶解度顯著性降低（P＜0.05）；4 ℃和0 ℃下酶活先升高后平緩；-20 ℃下酶活先升高后下降。低溫貯藏過程中，溫度越低，甲醛含量越低；各溫度下TMAOase活性與甲醛含量顯著相關(guān)；因此，低溫貯藏過程中酶學(xué)途徑是產(chǎn)生甲醛的主要途徑，通過控制酶的活性來控制魷魚甲醛的產(chǎn)生至關(guān)重要。