肖清煒，常媛媛，劉起發(fā)，臧小豪，胡蒙蒙，周 渭

（廣東工業(yè)大學 生物醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510006）

前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤，占據男性癌癥整體發(fā)病率第二位[1]。其中，發(fā)達國家的男性發(fā)病率要高于發(fā)展中國家[2]。但近年來，隨著醫(yī)療手段的進步與生活環(huán)境的變化，包括中國在內的發(fā)展中國家中男性前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[3]。針對癌癥的治療，早期診斷與精準治療是提高癌癥患者的生存率與治愈率的良好手段。 因此，研究與開發(fā)出一種前列腺癌的早期診斷治療手段是當前的研究熱點。

分子探針技術的開發(fā)極大地提高了對疾病的診斷效果[4]。其原理是利用某種疾病的特異性靶點開發(fā)出一種靶向性的分子影像探針從而達到診斷與治療的目的。因此，前列腺癌的早期診斷也可通過分子探針技術手段實現。其中，前列腺特異性膜抗原(Prostate specific membrane antigen, PSMA)作為前列腺癌的特異性靶點越來越受到研究者的關注[5]。

PSMA是一種表達在前列腺腫瘤上皮細胞，含有750個氨基酸的II型跨膜糖蛋白[6-7]，其與II型谷氨酸羧肽酶(GCPII)具有相同的酶活性。II型谷氨酸羧肽酶是存在于神經系統中用于催化水解Nacetylaspartylglutamate(NAAG)釋放谷氨酸的一種膜外金屬蛋白酶。但對于大腦神經系統，過量的谷氨酸會導致一系列的神經性疾病，包括中風、脊髓損傷、肌萎縮側索硬化(ALS)、周圍神經病變、慢性疼痛、精神分裂癥和癲癇[8]。抑制GCPII活性將有利于治療由谷氨酸釋放過多所引發(fā)的神經性疾病。因此，近年來，針對II型谷氨酸羧肽酶的抑制劑得以被研究與開發(fā)。如圖1所示，Cyril Barinka和Youngjoo Byun等[9]基于GCPII所作用的NAAG結構通過理論計算設計合成了含有谷氨酸-脲(Glu-Urea)骨架的GCPII型小分子抑制劑并通過多種評價手段對4種抑制劑的結合機理與結合效果進行了評價，實驗結果證明所設計合成的Glu-Urea骨架小分子抑制劑能夠與GCPII特異性結合。同時，因為PSMA與GCPII具有相同酶活性，因此所開發(fā)的小分子抑制劑也能與PSMA進行特異性結合，這給前列腺癌靶向性分子的開發(fā)提供了一種新的途徑[7,10]。當前，已經有不少研究利用PSMA的小分子抑制劑進行靶向分子探針或藥物的開發(fā)[10-14]。因此，設計出一條合適的PSMA小分子抑制劑及其類似物的全合成路線對促進前列腺癌靶向性分子影像探針及藥物的開發(fā)有著重要的意義。

圖 1 NAAG及4種具有Glu-Urea骨架的GCPII型小分子抑制劑分子結構[9]Fig.1 The molecular structure of NAAG and Four GCPII Small Molecular Inhibitors with Glu-Urea Framework

PSMA小分子抑制劑的合成路線已見諸報道，基本策略是以L-谷氨酸二叔丁基酯為起點，通過與其他氨基酸的氨基反應構成谷氨酸-脲骨架結構。例如，陳驍馳等[15]就提供了一種通過L-谷氨酸叔丁基二酯與芐氧羰基(Cbz)和叔丁氧羰基(Boc)保護的L-賴氨酸通過三光氣反應得到了具有Glu-Urea-Lys骨架的PSMA小分子抑制劑。但到目前為止，還沒有對以L-谷氨酸和L-賴氨酸為起始原料的合成路線的研究報道。因此，基于PSMA的小分子抑制劑及其類似物在前列腺癌分子影像學診斷及靶向治療中的作用，筆者提供了一種以L-谷氨酸和L-賴氨酸為起始原料的合成路線，為利用PSMA為靶點的前列腺癌的診斷與治療手段提供小分子抑制劑的合成策略。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

DF-101D型集熱式磁力攪拌器(鄭州予華)；DHJF-2005低溫攪拌反應浴(鄭州長城科工貿)；AVANCE III HD 400型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克)；Q Exactive型超高分辨液質聯用儀(Thermo-Filsher公司)；MCP 500自動旋光儀(德國安東帕公司)。

L-谷氨酸、L-賴氨酸等所有藥品均購自阿拉丁化學試劑公司，所有化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

如圖2所示，PSMA小分子抑制劑的合成將按以下路線進行，化合物1、2、3 ···與圖中所進行編號的化合物一一對應。

(1) L-谷氨酸二叔丁基酯(化合物1)的合成。

取5 g L-谷氨酸溶于100 ml的醋酸叔丁酯中并置于冰浴中攪拌5 min后，緩慢滴加2.0 eqv的70%高氯酸溶液，置于室溫攪拌過夜。反應終了后，將反應液降至0 ℃，并用冷的0.5 mol/L鹽酸(2×30ml)萃取，收集水相。再將碳酸鈉固體緩慢加入至水相中并攪拌至pH為8～10，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥。過濾后的液體減壓旋蒸得到目標化合物1，無色或淺黃色透明黏性液體。產率：47.6%，1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ :3.50～3.40 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.37 (t, J=7.5 Hz,2H), 2.02 (d, J=10.3 Hz, 1H), 1.90～1.76 (m, 1H), 1.47(t, J=8.9 Hz, 18H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ:173.95, 172.61, 81.73, 80.64, 54.11, 31.82, 29.44,28.09, 28.03。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H25NO4{[M+H]+}260.18524, found 260.18563,[α]D20=22.86 (C=0.687,CH3OH)。

(2) N6-(9 -芴甲氧羰基)-N2-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(化合物2)的合成。

圖 2 小分子抑制劑PSMA-1的合成路線Fig.2 The synthesis route of small molecule inhibitors PSMA-1

化合物2的合成分為兩步驟進行。第一步：17 g碳酸氫鈉加入到50 ml水中，攪拌形成堿液，將10 g L-賴氨酸鹽酸鹽加入其中攪拌15 min。再分批向反應器中加入7 g無水硫酸銅攪拌1h，后加入22.1 g 9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺碳酸酯和100 ml的四氫呋喃。攪拌14 h后加入100 ml碳酸氫鈉水溶液攪拌3 h。過后加入50 ml水和20 ml甲醇攪拌5 h后，加入50 ml乙酸乙酯攪拌30 min。最后過濾，濾渣至水洗為無色。真空干燥箱烘干后得到N6-Fmoc-L-賴氨酸的銅絡合物中間體。第二步：取烘干好的中間體10 g溶于四氫呋喃：水=1:1溶液中，依次分批加入10 g無水碳酸鈉與5 g 8-羥基喹啉。室溫攪拌2 h后往上述體系中加入6 g的二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)。繼續(xù)室溫攪拌5 h，過濾，濾液冷卻至5 ℃以下。用鹽酸調節(jié)pH至2～3，萃取得到粗產品，硅膠柱層析提純得到目標化合物2，黃色粘稠狀液體。兩步驟合并總產率：65%，1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.67 (t, J=6.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J=7.2 Hz,2H), 7.32 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.23 (t, J=7.3 Hz, 2H), 6.08(s, 0.4H), 5.58 (s, 0.2H), 5.13 (s, 0.6H), 4.85 (s, 0.8H),4.27 (dd, J=62.5, 28.3 Hz, 6H), 3.11 (d, J=5.9 Hz, 2H),1.89～1.22 (m, 13H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:176.46, 156.74, 155.88, 143.97, 127.70, 127.08, 125.09,119.98, 80.17, 66.70, 53.27, 47.27, 40.63, 32.05, 29.35,28.36, 22.44。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H32N2O6{[M-H]-}467.21884,found 467.21876。

(3) N6-(9 -芴甲氧羰基)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物3)的合成。

取化合物2(1.0 eqv，2 g)溶于50 ml的醋酸叔丁酯中低溫攪拌5 min，緩慢滴加1.5 eqv的70%高氯酸溶液，并置于室溫攪拌過夜。反應終了后，將反應液冷卻至0 ℃，小心加入2 mol/L的NaOH水溶液至pH為10。然后立即用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后過濾，硅膠柱層析提純得到目標化合物3，無色透明黏性液體。產率70%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.70 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.57 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.34 (t, J=7.4 Hz,2H), 7.26 (dd, J=9.9, 4.7 Hz, 2H), 4.39-4.24 (m, 1H),4.15 (d, J=8.3 Hz, 0H), 4.00 (t, J=5.9 Hz, 1H), 3.12 (s,1H), 1.94 (d, J=5.2 Hz, 1H), 1.46 (d, J=30.9 Hz, 14H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 171.28, 168.49,156.96, 143.99, 141.24, 127.66, 127.11, 125.26, 125.08,119.89, 84.69, 66.81, 60.45, 54.16, 47.12, 40.34, 29.97,29.13, 27.82, 21.72, 21.07, 14.21。HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H32N2O4{[M+H]+}425.24310, found 425.24348, [α]20D=7.9(C=1,CH3OH)。

(4) N6-(9 -芴甲氧羰基)-N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物4)的合成。

取化合物3(1.0 eqv，1 g)，溶解在二氯甲烷溶液中，置于0 ℃冰浴攪拌5 min后加入三光氣(0.4 eqv，0.28 g)并繼續(xù)在上述條件下反應，TLC跟蹤反應。反應1～2 h后加入化合物1(1.0 eqv，0.612 g)和二異丙基乙胺(DIEA)(4.0 eqv，1.22 g)冰浴攪拌10 min后移至室溫攪拌至TLC檢測反應完全。硅膠柱層析提純(石油醚：乙酸乙酯=4:1)得到目標化合物4，冷卻條件下為白色膏狀固體，置于室溫為無色透明粘稠狀固體。產率：75.3%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.75 (d,J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (t, J=6.4 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.4 Hz,2H), 7.30 (td, J=7.4, 0.9 Hz, 2H), 5.30 (d, J=8.1 Hz, 3H),4.48～4.28 (m, 4H), 4.21(s, 1H), 3.18 (s, 2H), 2.28 (d,J=6.8 Hz, 2H), 2.04 (s, 1H), 1.91～1.79 (m, 1H),1.67～1.29(m, 32H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:172.60, 172.49, 172.38, 156.98, 156.65, 144.07, 141.30,127.63, 127.04, 125.17, 119.92, 82.16, 81.73, 80.52,66.55, 53.35, 53.05, 47.33, 40.67, 32.69, 31.60, 29.34,28.33, 28.08, 28.04, 28.01, 22.37。HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C39H55N3O9{[M+Na]+}732.38275, found 732.38305。

(5) N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物5)的合成。

取2 g化合物4置于10%的二乙胺溶液中攪拌，TLC檢測反應完全。減壓旋蒸后柱層析提純(乙酸乙酯：甲醇=25:1至1:1)得到目標化合物5，黃色黏性固體。產率：70%，1H NMR (400 MHz, MeOD) δ:4.02(ddd, J=16.9, 8.4, 5.1 Hz, 2H), 2.51 (t, J=7.1 Hz, 2H),2.26～2.02 (m, 2H), 1.88 (dd, J=7.8, 5.9 Hz, 1H), 1.62 (s,2H), 1.52～1.42 (m, 1H), 1.42～1.22 (m, 31H)。13C NMR(101 MHz, MeOD) δ : 172.53, 172.33, 172.08, 158.56,81.38, 81.15, 80.33, 53.41, 52.80, 40.72, 31.99, 31.32,31.13, 27.63, 27.02, 26.97, 26.94, 22.53。HRMS(ESI)m/z: Calcd for C24H45N3O7{[M+H]+}488.33295, found 488.33303。

(6) N6-(對硝基苯氧羰基)-N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物6)的合成。

取化合物5(1.0 eqv，1 g)、三乙胺(1.0 eqv，0.21 g)溶于20 ml二氯甲烷溶液中，再加入對硝基苯基氯甲酸酯(1.2 eqv，0.49 g)，室溫下攪拌，TLC跟蹤反應，反應結束后用減壓旋蒸掉多余溶劑，硅膠柱層析提純(石油醚：乙酸乙酯=2:1)得到目標化合物6，無色透明黏性液體。產率：73%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ :8.288.20 (m, 2H), 7.39～7.30 (m, 2H), 6.01 (s, 1H), 5.29(d, J=8.1 Hz, 1H), 5.20 (s, 1H), 4.37 (qd, J=8.1, 4.8 Hz,2H), 3.27 (d, J=6.0 Hz,2H), 2.45～2.22 (m, 2H),2.15～2.02 (m, 1H), 1.95～1.72 (m, 2H), 1.65～1.54 (m,3H), 1.45 (dd, J=10.8, 7.6 Hz, 29H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 173.29, 172.37, 172.22, 157.25,156.33, 153.42, 144.52, 125.03, 121.89, 82.58, 81.80,80.67, 53.27, 53.01, 41.06, 32.72, 31.54, 28.81, 28.16,28.05, 28.01, 22.55。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C31H48N4O11{[M+H]+}675.32105, found, 675.32118。

(7) N6-(對硝基苯氧羰基)- N2-(N-甲?；?L-谷氨酸)-L-賴氨酸(PSMA-1)的合成。

取1 g化合物6溶于含有25%TFA的二氯甲烷溶液中反應16 h，反應液經減壓旋蒸掉多余溶液后硅膠柱層析提純(甲醇：乙酸乙酯=1:1)得到目標化合物7，無色透明黏性固體。產率：85%，1H NMR (400 MHz,MeOD) δ : 8.27 (d, J=9.1 Hz, 2H), 7.37 (d, J=9.1 Hz,2H), 4.33 (ddd, J=13.2, 8.3, 5.0 Hz, 2H), 3.23 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.49～2.37 (m, 2H), 2.23～2.08 (m, 1H),2.00～1.81 (m, 2H), 1.71 (dd, J=14.0, 7.3 Hz, 1H), 1.62(dd, J=11.4, 7.0 Hz, 2H), 1.51 (dd, J=14.9, 7.5 Hz, 2H)。13C NMR (101 MHz, MeOD) δ: 175.21, 174.63, 158.74,156.36, 154.30, 144.70, 124.68, 122.00, 52.68, 52.21,40.47, 31.65, 29.76, 28.78, 27.55, 22.45。HRMS(ESI)m/z: Calcd for C19H24N4O11{[M-H]-}483.13697, found 483.13688, [α]20D=11.3(C=1,CH3OH)。

2 結果與討論

本文以L-谷氨酸和L-賴氨酸等基礎化合物為原料，共計7步反應得到具有Glu-Urea-Lys骨架的PSMA小分子抑制劑類似物。各步驟產物均進行了1H NMR、13C NMR及高分辨質譜表征，對化合物1，3與7進行了旋光測試證明其仍保持光學活性。各步驟產率除化合物1的合成外均高于60%，線路總產率為18%。兩種初始中間體, 化合物1與化合物3的產率分別為47.6%與65%。伴隨著目標產物的合成，筆者開發(fā)了一種針對L-賴氨酸羧基與ε氨基保護基保護的合成新思路。中間體化合物3的合成本質上是氨基酸活性基團的保護與脫保護。我們首先通過9-芴甲基氧羰基與叔丁氧羰基對L-賴氨酸ε氨基與α氨基進行了保護，合成得到了化合物2。相較于其他文獻中ε氨基進行芐氧羰基保護的L-賴氨酸中間體，9-芴甲基的優(yōu)點在于其脫保護時只需要二乙胺等有機胺即可短時間內脫除，對比芐氧羰基的Pt/C +H2脫除法，成本更低，實驗更安全。其次，在合成化合物3的過程中，我們通過運用醋酸叔丁酯與70%HClO4的實驗條件，一步反應實現了對L-賴氨酸羧基的Boc保護與α氨基的Boc脫保護。

如圖3所示，I號路線為化合物3潛在的一般性合成路線，其合成過程為，首先對賴氨酸兩個氨基進行保護，然后用叔丁基對羧基進行保護，最后選擇性脫除α位Boc保護基得到化合物3。II號路線為筆者優(yōu)化改進路線，兩種路線相比，I號路線比II號路線多一個步驟，且由于叔丁醇的位阻較大，其與羧基的酯化反應將較為困難，在實際的合成過程中，其酯化產率低于30%，且后面還有一個Boc脫除的步驟，使化合物2到化合物3的產率低于20%。因此，我們設計了II號路線來達到合成化合物3的目的，首先仍然是對L-賴氨酸的兩個氨基進行保護，在得到化合物2后，利用醋酸叔丁酯與70%HClO4與羧基進行酯交換反應得到L-賴氨酸叔丁酯衍生物。與此同時，在反應過程中，利用HClO4的強酸性，反應還伴隨著氨基上的Boc脫除進而實現一步合成化合物3的目的，II號路線的設計不僅減少了反應步驟，而且將化合物3的產率從I號路線的小于20%提高到70%。

圖 3 化合物3的合成優(yōu)化策略Fig.3 Optimized strategy for the synthesis of compound 3

3 結論

本文提供了一種PSMA小分子抑制劑的合成策略，以期望用于輔助開發(fā)靶向前列腺癌的分子探針及靶向治療藥物。合成路線中所選用的原料便宜易得，反應過程條件溫和，有著18%的反應總產率。同時，在開發(fā)PSMA小分子抑制劑的合成路線過程中，本文提供了一種一步法實現賴氨酸羧基與ε氨基Boc保護與脫保護的合成思路。