張久榮， 林勇， 徐春華， 胡慧娣， 呂亞軍

(1. 南京市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 南京210029； 2. 南京市胸科醫(yī)院病理科， 江蘇 南京210029； 3. 常州市武進人民醫(yī)院胸心外科， 江蘇 常州 213017)

每年約有160萬人死于肺癌[1]，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是最常見的亞型，占80%～85%。超過一半的NSCLC患者在確診時已是Ⅳ期，無法行手術(shù)治療，導(dǎo)致患者預(yù)后差[2]。目前NSCLC患者的5年生存率不足15%，且復(fù)發(fā)率較高[3]。Twist蛋白由TWIST家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(TWIST family bHLH transcription factor 1，TWIST1)編碼，是一種含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。，而Fascin蛋白由束蛋白結(jié)合蛋白1(Fascin actin-bundling protein 1，F(xiàn)SCN1)編碼，其在多種腫瘤中呈高表達，廣泛參與癌細胞增殖、侵襲和遷移等，且是霍奇金淋巴瘤及EB病毒相關(guān)淋巴瘤的腫瘤標(biāo)志物[5]。目前，關(guān)于TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，本研究擬應(yīng)用生物信息學(xué)及臨床標(biāo)本分析TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

TCGA可視化網(wǎng)站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)包含多種腫瘤的表達譜數(shù)據(jù)，在該網(wǎng)站首頁分別輸入“TWIST1”及“FSCN1”，點擊“GoPIA”之后網(wǎng)站會自動彈出mRNA相關(guān)信息以及在不同腫瘤中的表達情況。進一步在該網(wǎng)站“Expression DIY”及“Survival Analysis”模塊下分析TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC兩種主要病理類型(肺腺癌和肺鱗癌)中的表達及臨床意義。此外，在“Correlation”模塊下分析TWIST1 mRNA與FSCN1 mRNA在肺腺癌及肺鱗癌中表達的相關(guān)性。

1.2 病例

本研究所有臨床標(biāo)本均從南京市胸科醫(yī)院胸外科獲取，從2015年1月至12月共搜集到69對NSCLC組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)，所有患者均接受根治性切除手術(shù)并且術(shù)前未進行放療、化療?；颊吲R床資料(病理類型、性別、年齡、吸煙史、TNM分期等)從病歷記錄中獲取，病理類型由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師確定。69例腫瘤標(biāo)本中，肺腺癌39例，肺鱗癌30例；男36例，女33例；年齡38～78歲，中位年齡60歲，其中32例<60歲，37例≥60歲；吸煙者35例，非吸煙者34例；Ⅰ期24例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。組織標(biāo)本浸泡在RNA保護液中，于-80 ℃保存。該研究經(jīng)南京市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并且獲得患者知情同意。

此外，對69例NSCLC中TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表達進行排序，將前35例定義為高表達組，將后34例定義為低表達組，分析TWIST1及FSNC1與患者臨床病理特征的相關(guān)性。

1.3 組織RNA提取

切取組織，磨成碎片，加入Trizol 試劑(美國Thermo公司)裂解組織，并于4 ℃行12 000×g離心15 min；取上清液加入氯仿，室溫靜置5 min，并如上述操作離心；吸取上層水相至新EP管，加入異丙醇，于4 ℃行12 000×g離心10 min；取沉淀加入75%乙醇，于4 ℃行7 500×g離心5 min，獲得RNA沉淀。根據(jù)沉淀的量，加入適當(dāng)體積的無RNA酶水溶解RNA產(chǎn)物，并利用分光光度計(北京普析公司)檢測其濃度。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在EP管中加入4 μL 5×反轉(zhuǎn)錄試劑混合液，1 μg RNA(根據(jù)濃度加入適當(dāng)體積)，并用無酶水定容至20 μL?；靹蚍磻?yīng)體系后，PCR儀(美國Stratagene公司)中設(shè)置反應(yīng)體系：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保持。獲取目標(biāo)cDNA后進行實時定量PCR檢測。

1.5 實時定量PCR檢測TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表達

引物由南京金斯瑞生物工程公司合成。TWIST1上游引物為5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，下游引物為5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′，擴增長度156 bp；FSCN1上游引物為5′-CCAGGGTATGGACCTGTCTG-3′，下游引物為5′-GTGTGGGTACGGAAG GCAC-3′，擴增長度105 bp；GAPDH上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，擴增長度197 bp。在96孔板中，每個反應(yīng)中加入10 μL 發(fā)光反應(yīng)液，0.4 μL正向引物，0.4 μL反向引物，0.4 μL 熒光標(biāo)準(zhǔn)液，5 μL cDNA模板以及3.8 μL蒸餾水，共20 μL體系。行PCR擴增：95 ℃預(yù)變性 30 s；5 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。使用管家GAPDH mRNA作為內(nèi)參，以癌旁組織為對照組，使用2-ΔΔCT方法分別計算TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在NSCLC中的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GEPIA生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在NSCLC中表達及臨床相關(guān)性 GEPIA網(wǎng)站分析顯示，與癌旁組織相比，TWSIT1 mRNA和FSCN1 mRNA在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達明顯升高(P均<0.05)，其中肺鱗癌更明顯。生存分析顯示，TWIST1 mRNA 與患者的總體生存期無明顯相關(guān)(P=0.160)；而FSCN1 mRNA與患者預(yù)后相關(guān)，F(xiàn)SCN1 mRNA低表達者總體生存期較高表達者更長(P=0.007)。見圖1。

圖1 GEPIA網(wǎng)站中TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 在NSCLC中的表達及與總體生存期的關(guān)系

2.1.2 TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表達在肺腺癌和肺鱗癌中的相關(guān)性 進一步分析GEPIA發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表達呈中等程度正相關(guān)(r=0.41，P<0.01)，在肺鱗癌中兩者表達呈弱相關(guān)(r=0.17，P<0.01)。見圖2。

2.2 臨床標(biāo)本驗證結(jié)果

2.2.1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 在NSCLC中表達及相關(guān)性 結(jié)果表明，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在69對NSCLC組織中表達明顯高于對應(yīng)的癌旁組織(t=7.452，15.12，P<0.01)。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.630，P<0.01)。見圖3。

圖2 NSCLC中TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA表達相關(guān)性

圖3 TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC中表達及相關(guān)性

2.2.2 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 分析結(jié)果表明，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表達與患者TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，但與患者的性別、年齡、吸煙史以及病理類型均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA的表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

TWIST1 mRNA在人類胚胎發(fā)育的過程中起重要作用，常通過與特定的DNA序列結(jié)合調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮功能[6-8]。以往研究發(fā)現(xiàn)，TWIST1在胃癌中促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]；也有研究表明TWIST1在頭頸癌的遠處轉(zhuǎn)移[10]以及胃癌的腫瘤耐藥中發(fā)揮促癌作用[11]。本研究顯示，TWIST1在NSCLC中異常高表達，且表達與患者的臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，提示TWIST1可能與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。此外，TWIST1與患者性別、年齡、吸煙史均無關(guān)，表明TWITST1在NSCLC中表達相對穩(wěn)定，不受外界因素影響。而生存分析顯示TWIST1與患者的總體生存期無明顯相關(guān)，因此，TWIST1是否參與NSCLC遠處轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活等還需進一步研究。

FSCN1在調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)，維持細胞黏附，協(xié)調(diào)運動和侵襲等生物學(xué)途徑中發(fā)揮重要作用[12]。近年來研究證實FSCN1在多種腫瘤中表達上調(diào)[13-14]，并且在霍奇金淋巴瘤及EB病毒相關(guān)淋巴瘤中可作為腫瘤標(biāo)志物[15]，可作為胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后和復(fù)發(fā)時間的預(yù)測指標(biāo)[16]，能促進腫瘤細胞的免疫逃逸[17]。本研究發(fā)現(xiàn)FSCN1 mRNA在NSCLC中高表達并且與患者的預(yù)后相關(guān)，F(xiàn)SCN1 mRNA高表達患者其總體生存期低于低表達者。由此表明，F(xiàn)SCN1 mRNA可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起促癌作用，且能進一步影響患者預(yù)后。此外，相關(guān)性分析顯示，TWIST1 mRNA與FSCN1 mRNA在NSCLC中表達呈正相關(guān)，提示TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的功能可能存在交叉協(xié)同作用。但兩者相關(guān)性較弱，其原因可能是TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表達受到多種不同信號通路的調(diào)控。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在肺腺癌中高表達并且與患者的臨床病理分期及預(yù)后密切相關(guān)，二者呈弱相關(guān)。本研究未闡明TWIST1和FSCN1在NSCLC中的生物學(xué)作用及作用機制，有待進一步研究。