李幗瑞， 龐吉， 錢海， 吳燕， 陳永昌

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

蛋白質(zhì)磷酸化是最常見的蛋白翻譯后修飾之一[1]。多數(shù)蛋白質(zhì)磷酸化發(fā)生在胞內(nèi)，由分布在細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶催化完成。但是，細(xì)胞外的蛋白質(zhì)也有磷酸化的現(xiàn)象，早在1883年，就已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外蛋白質(zhì)酪蛋白的磷酸化，但引起其磷酸化的蛋白激酶一直未找到[2]。直到130年后，Tagliabracci發(fā)現(xiàn)Fam20C作為一種分泌型蛋白激酶在起作用[2-3]。自此，分泌型蛋白激酶引起人們高度重視，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)VLK、c-Src酪氨酸激酶等多種分泌型蛋白激酶[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，cGMP依賴性蛋白激酶Ⅱ(type Ⅱ cGMP-dependent protein kinase，PKG Ⅱ)也是一種分泌型蛋白激酶[7]。但是，分泌到胞外的PKG Ⅱ?qū)?xì)胞的作用及機(jī)制尚不明確。 為此，本研究采用重組蛋白PKG Ⅱ在細(xì)胞外直接作用于胃癌細(xì)胞的方式來模擬分泌型蛋白的作用模式，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析進(jìn)行初步篩選， 結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，初步探索分泌型PKG Ⅱ?qū)θ宋赴〩GC-27和AGS細(xì)胞株基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和試劑 人胃癌HGC-27和AGS細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清(美國(guó)Excell公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液，二甲基亞砜，焦碳酸二乙酯均為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；F12K培養(yǎng)液(加拿大Wisent公司)；人谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)-PKG Ⅱ融合蛋白(加拿大Signalchem公司)；8-pCPT-cGMP(美國(guó)Biolog公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；β-巰基乙醇(美國(guó)Sigma公司)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)參照物(美國(guó)Thermo Fisher公司)；抗人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)前體多克隆抗體(美國(guó)Novus公司)；β-肌動(dòng)蛋白抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(美國(guó)Jackson公司)；ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，普通PCR儀均為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；恒溫水浴鍋(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超微量蛋白核酸分析儀(北京美林恒通儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(美國(guó)Emerson公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，蛋白電泳儀均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；干式恒溫器(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；凝膠成像及分析系統(tǒng)(北京賽智公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌HGC-27細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取總RNA，用超微量蛋白核酸分析儀對(duì)得到的樣品進(jìn)行濃度及純度鑒定。將D(260 nm)/D(280 nm)在1.8～2.0之間的樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，立即進(jìn)行后續(xù)研究或置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序廣泛應(yīng)用于各個(gè)物種基因差異表達(dá)的研究，現(xiàn)有的商業(yè)化深度測(cè)序技術(shù)中Illumina HiSeq 2000具有高輸出量和低成本的優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用最為廣泛的測(cè)序平臺(tái)之一[8-9]。對(duì)使用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽在桿狀病毒Sf 9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組全長(zhǎng)人PKG Ⅱ(GST-PKG Ⅱ, 100 μg/L)處理前、后的胃癌AGS細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序：加藥4 h后提取細(xì)胞中總RNA，行質(zhì)量檢測(cè)，采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)濃度、純度和完整性符合測(cè)序質(zhì)量要求的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。該部分實(shí)驗(yàn)交由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。將整理后的轉(zhuǎn)錄本通過基于局部對(duì)比算法的搜索工具(BLAST)BLASTn及BLASTx程序與蛋白相鄰類的聚簇(COG)、基因本體(Gene Ontology, GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、Pfam、Swiss-prot和NR非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)等7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比。以FDR≤0.05、│log2(FPKMGST-PKG II組/FPKM對(duì)照組) │>1為條件篩選出表達(dá)差異≥2倍的基因，再?gòu)闹泻Y選出部分與增殖相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證重組PKG Ⅱ?qū)Y選出的增殖相關(guān)基因mRNA水平的影響 將匯合度達(dá)70%左右的HGC-27和AGS細(xì)胞消化后接種于6孔板，分為2組：對(duì)照組和GST-PKG Ⅱ (100 μg/L)+ 8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)組。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，換無血清培養(yǎng)液饑餓處理8～12 h；棄上清液，無菌PBS清洗；加入相應(yīng)濃度藥物處理4 h。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Ⅰ預(yù)混試劑5 μL，前引物(5 μmol/L)0.4 μL，后引物(5 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，加雙蒸水將體系總體積調(diào)整至10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算候選基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qRT-PCR所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)EGF前體的表達(dá) 培養(yǎng)細(xì)胞，待匯合度達(dá)70%時(shí)用胰蛋白酶消化，接種于6孔板中，分為5組：對(duì)照組、GST(100 μg/L)組、GST-PKG Ⅱ(100 μg/L)組、GST+8-pCPT-cGMP(250 μmol/L)組、GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP組。待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí),更換無胎牛血清的培養(yǎng)液饑餓處理8～12 h；棄培養(yǎng)液，PBS沖洗；加相應(yīng)濃度的藥物處理24 h；裂解細(xì)胞，提取總蛋白，煮沸變性后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg行SDS-PAGE，70 V恒壓電泳；冰上300 mA恒流120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；目的條帶用以5%牛血清白蛋白1 ∶500稀釋的EGF前體蛋白多克隆抗體4 ℃孵育過夜；TBST清洗3次，再分別以TBST 1 ∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體和β-肌動(dòng)蛋白抗體室溫孵育目的條帶和內(nèi)參1 h；TBST清洗3次；ECL發(fā)光液顯色、凝膠成像系統(tǒng)掃描成像后用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)受重組PKG Ⅱ調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選

對(duì)GST-PKG Ⅱ處理前、后的胃癌AGS細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，質(zhì)控后分別得到24.36 Gb和27.61 Gb的數(shù)據(jù)。對(duì)拼接后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組注釋，將組裝后的轉(zhuǎn)錄本通過BLASTn及BLASTx程序與COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-prot和NR共7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，分別獲得7 034、16 850、10 729、13 308、18 575、18 311和20 227條同源對(duì)比信息，具體如表2所示。

共篩選出579個(gè)差異表達(dá)基因。其中，在GST-PKG Ⅱ作用下267個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，312個(gè)顯著下調(diào)(圖1)。將所篩選出的差異表達(dá)基因與COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，共獲得93個(gè)注釋信息，劃分為19個(gè)功能類別：分布最多的是一般功能預(yù)測(cè)基因，達(dá)31個(gè)(R)；其次為涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的功能基因(E)，共有11個(gè)；功能涉及復(fù)制、重組與修飾(L)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T)的基因各有10個(gè)，詳見圖2。

表2 胃癌細(xì)胞株AGS全轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果

虛線以下的點(diǎn)無意義；虛線以上的點(diǎn)表示FDR≤0.05且│log2(FPKMGST-PKG II組/FPKM對(duì)照組)│>1的基因；其中，右側(cè)虛線以右者表示在GST-PKG Ⅱ作用后表達(dá)上調(diào)，左側(cè)虛線以左者表示表達(dá)下調(diào)

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

A：RNA加工和修飾；B：染色體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C：能量生成與轉(zhuǎn)化；D：細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞分裂，染色體分離；E：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；F：核酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；I：脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；J：翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制，重組與修飾；M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜生物發(fā)生；N：細(xì)胞活性；O：翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊，伴侶；P：無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q：次級(jí)代謝物生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝；R：一般功能預(yù)測(cè)；S：未知功能；T：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U：細(xì)胞間運(yùn)輸，分泌物和膜泡運(yùn)動(dòng)；V：防御機(jī)制；W：胞外結(jié)構(gòu)；Y：核結(jié)構(gòu)；Z：細(xì)胞骨架

圖2 差異表達(dá)基因COG功能注釋分布圖

對(duì)579個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，共獲得2 749個(gè)注釋。將其功能劃分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三大類：其中，關(guān)于生物過程的注釋最多，共有1 254個(gè)；其次為細(xì)胞組分，有1 089個(gè)GO注釋；分子功能有406個(gè)注釋。全轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)基因GO功能分類的詳細(xì)情況見圖3。

每個(gè)亞分類中左側(cè)表示全部基因的GO功能注釋數(shù)，右側(cè)代表差異表達(dá)基因的GO功能注釋數(shù)圖3 GO功能分類

進(jìn)一步功能分類顯示，579個(gè)差異表達(dá)基因中，58個(gè)與腫瘤生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān)，20個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)，9個(gè)與心臟活動(dòng)有關(guān)，具體如圖4所示。根據(jù)對(duì)差異表達(dá)基因的功能注釋，提示分泌型PKG Ⅱ參與細(xì)胞生長(zhǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及心臟活動(dòng)等多種生物功能調(diào)節(jié)。重點(diǎn)篩選出與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的9個(gè)候選基因(EGF、FGF7、MARK1、GLI1、COL6A3、DFNA5、SEPT4、DACT1、PSCA，分別編碼表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7、微管親和調(diào)節(jié)激酶1、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1、Ⅵ型膠原蛋白α3鏈、耳聾相關(guān)基因Gasdermin-E、Septin-4、β-環(huán)連蛋白抑制基因1、前列腺干細(xì)胞抗原)，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證及分析。

圖中顏色深淺表示與對(duì)照組相比的表達(dá)差異，顏色越深表明表達(dá)差異越大；↓：表達(dá)下調(diào)的基因；*：后續(xù)重點(diǎn)篩選出的候選基因

圖4 部分差異表達(dá)基因及其功能注釋

2.2 重組PKG Ⅱ?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在GST-PKG Ⅱ和8-pCPT-cGMP共同作用下，HGC-27和AGS細(xì)胞中FGF7和MARK1等mRNA水平比較均無明顯差異(P均>0.05)；EGFmRNA水平明顯降低(P<0.01)，DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平明顯增高(P<0.01或<0.05)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一致；兩個(gè)細(xì)胞株中GLI1、COL6A3和SEPT4 等mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，表明重組PKG Ⅱ在不同胃癌細(xì)胞株中發(fā)揮的作用并不完全一致(圖5)。

2.3 重組PKG Ⅱ?qū)ξ赴┘?xì)胞中EGF表達(dá)的影響

如圖6所示，HGC-27細(xì)胞中，與對(duì)照組及GST組相比，GST-PKG Ⅱ組、GST+cGMP組和GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白水平均明顯下調(diào)(P均<0.01)，且與GST-PKG Ⅱ組相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白水平下調(diào)更為明顯(P<0.01)；AGS細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，GST組、GST-PKG Ⅱ組、GST+cGMP組和GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.01)，但與GST-PKG Ⅱ組相比，GST-PKG Ⅱ+cGMP組EGF前體蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較圖5 增殖相關(guān)基因的mRNA水平

1：對(duì)照組；2：GST組；3：GST-PKG Ⅱ組；4：GST+8-pCPT-cGMP組；5：GST-PKG Ⅱ+8-pCPT-cGMP組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與GST-PKG Ⅱ組比較；c：P<0.01，與GST組比較

圖6 各組EGF前體蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

為研究PKG Ⅱ作為分泌型蛋白激酶對(duì)腫瘤基因表達(dá)的調(diào)控作用，本研究首先通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選出579個(gè)差異表達(dá)基因，267個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，312個(gè)顯著下調(diào)，涉及腫瘤生物學(xué)活動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能和心臟功能等多個(gè)方面。這些差異表達(dá)基因中個(gè)別基因的功能也有部分重疊：其中CDON具有抑制增殖和遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)參與神經(jīng)前體細(xì)胞遷移和神經(jīng)元分化的正調(diào)節(jié)，在心肌重塑中也發(fā)揮一定的作用[10-13]。為增加研究結(jié)果的可靠性，本研究采用HGC-27和AGS兩個(gè)細(xì)胞株對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示從579個(gè)差異表達(dá)基因中篩選出的9個(gè)候選基因中有4個(gè)mRNA水平的變化趨勢(shì)在兩個(gè)細(xì)胞株中均與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，即在重組PKG Ⅱ作用下，EGF表達(dá)下調(diào)，而DFNA5、DACT1和PSCAmRNA表達(dá)上調(diào)。由此表明，該測(cè)序結(jié)果對(duì)研究分泌型PKG Ⅱ?qū)?xì)胞基因表達(dá)的影響有一定的參考價(jià)值。

進(jìn)一步得到驗(yàn)證的4個(gè)基因——EGF、DFNA5、DACT1和PSCA在腫瘤細(xì)胞增殖中均具有重要的調(diào)控作用：Akino等[14]發(fā)現(xiàn)，DFNA5/GSDME因異常甲基化所致的沉默在原發(fā)性胃癌中常有發(fā)生，而將外源DFNA5導(dǎo)入NUGC3沉默細(xì)胞可抑制新霉素抗性菌落形成，逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，提示DFNA5可能在胃癌中起到生長(zhǎng)抑制作用；Rogers等[15]發(fā)現(xiàn)活化的caspase-3可以裂解DFNA5/GSDME，產(chǎn)生靶向透化質(zhì)膜的壞死性DFNA5-N末端片段，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DACT1啟動(dòng)子甲基化在許多研究中均有報(bào)道，包括胃癌[16]、食管鱗狀細(xì)胞癌[17]和鼻咽癌[18]等，其異常甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[16-17]，在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均表現(xiàn)出對(duì)胃癌的抑制作用[19]。DACT1過表達(dá)還可通過抑制KG-1α增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制白血病發(fā)生和進(jìn)展[20]。PSCA在前列腺癌中高表達(dá)，但在胃癌和食管癌中卻幾乎不表達(dá)[21]，敲除PSCA基因在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，體外試驗(yàn)中PSCA高表達(dá)可抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖[22]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道EGF與腫瘤細(xì)胞增殖密切關(guān)聯(lián)[23-24]。由此得出，分泌型PKG Ⅱ可能通過下調(diào)EGF表達(dá)，同時(shí)上調(diào)DFNA5、DACT1和PSCA表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖，最終抑制腫瘤生長(zhǎng)。

除了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用外，本次測(cè)序結(jié)果還顯示重組PKG Ⅱ?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)功能調(diào)控和心臟活動(dòng)的眾多基因都有明顯的調(diào)節(jié)作用。例如，重組PKG Ⅱ除了可以通過調(diào)節(jié)編碼鈉/鈣交換蛋白2的SLC8A2(NCX2)表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)[25-26]；還可通過增強(qiáng)SLC8A2表達(dá)，維持突觸完整性和突觸密度、保證正常的認(rèn)知和記憶[27]；此外，PKG Ⅱ還可能通過上調(diào)編碼二氫嘧啶脫氫酶4的DPYSL4表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)[28]，保證神經(jīng)突的正常形成、神經(jīng)元正常分化，增加樹突的數(shù)量及長(zhǎng)度[29]?？梢?，分泌型PKG Ⅱ除了可以通過調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)活動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還可能參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的活動(dòng)。

對(duì)EGF前體蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，在GST-PKG Ⅱ作用下，HGC-27和AGS細(xì)胞中EGF前體蛋白水平較對(duì)照組明顯降低，加入8-pCPT-cGMP后，GST-PKG Ⅱ?qū)GC-27細(xì)胞中EGF前體蛋白表達(dá)的抑制作用更為明顯。GST對(duì)HGC-27細(xì)胞中EGF前體表達(dá)無抑制作用，而cGMP加入可能引起細(xì)胞中內(nèi)源性PKG Ⅱ的激活，進(jìn)而導(dǎo)致EGF前體表達(dá)下調(diào)。對(duì)于AGS細(xì)胞株，GST對(duì)EGF前體表達(dá)也有一定的抑制作用，但與GST組相比，重組PKG Ⅱ組EGF前體表達(dá)明顯降低(P<0.01)，表明重組蛋白GST-PKG Ⅱ中PKG Ⅱ?qū)GF前體表達(dá)有抑制作用，而非單純GST起作用。cGMP的加入同樣可能導(dǎo)致AGS細(xì)胞株中內(nèi)源性PKG Ⅱ的激活，從而引起EGF前體表達(dá)降低。在AGS細(xì)胞株中，GST-PKG Ⅱ+cGMP組與GST-PKG Ⅱ組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明cGMP激活并不能增強(qiáng)重組PKG Ⅱ?qū)GF前體蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，PKG Ⅱ能夠作為一種分泌型蛋白激酶調(diào)控EGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但其抑制EGF表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。