王志鵬， 李堅， 袁榮霞， 汪毅

(江蘇大學附屬醫(yī)院 1. 呼吸內(nèi)科， 2. 中心實驗室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其總的5年生存率約為15%[1]，其中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者約占85%[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究證實，lncRNAs在肺癌、乳腺癌、結腸癌等多種類型的腫瘤細胞中表達異常，起促癌或抑癌作用[3]。近年來研究表明，多種lncRNAs可作為預測NSCLC預后的潛在生物標志物，例如lncRNA PVT1[4]、lncRNA H19[5]和lncRNA CCHE1[6]等。肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)是從AFAP1編碼基因位點的反義DNA鏈衍生而來，其在結直腸癌[7]、乳腺癌[8]以及膽囊癌[9]組織中表達上調(diào)。Yin等[10]報道，lncRNA AFAP1-AS1通過表觀抑制p21表達來調(diào)控NSCLC細胞增殖，且其高表達預示NSCLC患者預后不佳。Y染色體性別決定基因簇2重疊轉(zhuǎn)錄本(sex-determining region of Y chromosome-box2 overlapping transcript，SOX2OT)是一個在多種疾病中呈異常表達的lncRNA，在腫瘤進展中起重要調(diào)控作用[11]，在胃癌[12]、肝細胞癌[13]以及結直腸癌[14]等組織中呈高表達。Hou等[15]研究指出，lncRNA SOX2OT調(diào)控肺癌細胞增殖生長，是預測肺癌患者預后不良的標志物。但是，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT是否可用于診斷NSCLC尚不完全清楚。為此，本研究以NSCLC患者和良性肺病患者為研究對象，通過熒光定量PCR方法檢測血漿中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT相對表達量，探討二者診斷NSCLC的可行性及臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 入組病例

選擇2017年1月至2019年2月江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科NSCLC患者，共48例；另選取同期住院的良性肺病患者48例作為對照組，其中，社區(qū)獲得性肺炎15例，慢性阻塞性肺疾病13例，間質(zhì)性肺病8例，結核性胸膜炎7例，支氣管哮喘5例。所有NSCLC患者均根據(jù)病理組織學結果確定診斷，均未接受過任何治療?；颊吣挲g、性別、臨床分期、吸煙史、淋巴結轉(zhuǎn)移等臨床資料由病歷獲得。

患者均簽署書面知情同意書。本研究符合人體試驗倫理學標準，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 全血標本采集與血清癌胚抗原測定

抽取受試者空腹肘正中靜脈全血2 mL于EDTA抗凝管中，于30 min內(nèi)行如下處理：4 ℃行3 000 r/min離心10 min，提取血漿500 μL，用1.5 mL無RNA酶的EP管進行分裝，凍存于-70 ℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，留取每位入組患者的2 mL血液標本于促凝管中，送至本院核醫(yī)學科，采用微粒子免疫發(fā)光測定法檢測血清癌胚抗原水平。根據(jù)試劑盒說明書標明的癌胚抗原正常上限設為5 μg/L。

1.3 主要試劑和儀器

Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；氯仿、異丙醇、75%乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將“1.2”中標本常溫解凍，加600 μL Trizol，振蕩；加200 μL氯仿，振蕩；4 ℃ 12 000×g離心15 min；吸取上層水相，加入水相等量異丙醇冰浴15 min，沉淀總RNA；4 ℃ 12 000×g離心10 min；取沉淀，75%乙醇洗滌2次；60 ℃孵育10 min；加入DEPC水充分溶解；測定RNA純度，[D(260 mm)/D(280 mm)]=1.8～2.0為合格可用標本，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將試劑和總RNA配置成20 μL反應體系(此過程均在冰上進行)。設置逆轉(zhuǎn)錄儀反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃隨機。反應結束后，將標本cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實時熒光定量PCR檢測血漿中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT的表達

按說明書將試劑和cDNA配置成20 μL反應體系(此過程均在冰上進行)。設置實時熒光定量PCR儀反應程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)記錄CT值，采用2-ΔΔCt方法計算lncRNA的相對表達量。選擇5S rRNA作為內(nèi)參基因。目的基因和內(nèi)參基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見表1。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平

由圖1可見，NSCLC患者血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平明顯高于良性對照組(t=6.236，5.680，P均<0.01)。

圖1 NSCLC患者和良性對照者血漿中l(wèi)ncRNAAFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平比較

2.2 NSCLC患者血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平與臨床病理特征的關系

結果顯示，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平與NSCLC患者的腫瘤病理組織學類型明顯相關，肺腺癌患者血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平均明顯高于肺鱗狀細胞癌患者(t=2.067，2.717，P均<0.05，圖2)；而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移情況和吸煙史等臨床病理特征均無明顯相關(P均>0.05)，見表2。

圖2 肺腺癌患者與鱗狀細胞癌患者血漿中l(wèi)ncRNAAFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平比較

表2 NSCLC患者血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平與臨床病理特征的關系

2.3 血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達診斷NSCLC效能的評價

如圖3所示，lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT診斷NSCLC的AUC值分別為0.875 (95%CI： 0.804～0.947，P<0.05)和0.787 (95%CI: 0.691～0.883，P<0.05)，相似于血清癌胚抗原診斷NSCLC的AUC值(0.836, 95%CI： 0.752～0.908，P<0.05)。二者聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.901(95%CI: 0.832～0.968，P<0.05)，再聯(lián)合血清癌胚抗原診斷NSCLC的AUC為0.914(95%CI： 0.849～0.978，P<0.05)，均高于其單獨檢測。見圖3。

由表3結果顯示，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT診斷NSCLC的敏感性(87.4%、73.0%)、特異性(86.2%、81.9%)及準確度(84.3%、78.6%)與血清癌胚抗原相似，二者聯(lián)合可提高診斷效能，再聯(lián)合血清癌胚抗原可進一步增高診斷的敏感性(91.2%)、特異性(94.1%)和準確度(94.8%)。

圖3 各指標單獨及聯(lián)合檢測診斷非小細胞肺癌的ROC曲線

表3 lncRNA AFAP1-AS1，lncRNA SOX2OT和癌胚抗原單獨和聯(lián)合診斷NSCLC的效能

3 討論

本研究結果顯示，NSCLC患者血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT的表達水平顯著高于良性肺病患者(P< 0.01)，同時ROC曲線分析結果顯示，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT鑒別NSCLC和良性肺病的AUC分別為0.875和0.787，與經(jīng)典的腫瘤標志物癌胚抗原診斷NSCLC的AUC相似。上述結果說明，lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT可作為診斷NSCLC的生物標志物。

聯(lián)合檢測多項生物標志物可提高診斷腫瘤的準確性[16]，Xie等[17]研究顯示，lncRNA SOX2OT在NSCLC組織以及患者血清標本中表達明顯上調(diào)，血清lncRNA SOX2OT測定診斷NSCLC的AUC是0.745，將其與另一個lncRNA(ANRIL)及癌胚抗原、細胞角蛋白19、鱗癌抗原等三個血清腫瘤標志物聯(lián)合獲得的AUC為0.853。Tong等[18]發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血漿lncRNA POU3F3診斷食管癌的AUC達0.842，其與血清鱗狀細胞癌抗原結合可使AUC升高至0.926，二者聯(lián)合也能有效地診斷早期食管癌。本研究表明，通過聯(lián)合檢測血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT以及再聯(lián)合血清癌胚抗原可進一步提高診斷NSCLC的AUC。血漿lncRNA AFAP1-AS1診斷NSCLC的總體效果稍優(yōu)于癌胚抗原，但是lncRNA SOX2OT的敏感性與特異性略遜于癌胚抗原。然而，血漿lncRNA AFAP1-AS1與lncRNA SOX2OT聯(lián)合可提高診斷的準確性，再結合血清癌胚抗原可進一步增高診斷效能。由此證實，多項生物標志物聯(lián)合檢測可提高診斷NSCLC效能，當暫時難以或無法獲取組織標本確定診斷時，可通過聯(lián)合檢測lncRNA AFAP1-AS1、lncRNA SOX2OT以及癌胚抗原水平輔助診療。

先前Deng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者腫瘤組織中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1表達量明顯高于癌旁組織，NSCLC患者lncRNA AFAP1-AS1表達與患者臨床分期、吸煙史、淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關，而與患者性別和年齡無關。另有研究[20]表明，NSCLC患者血液lncRNA GAS5表達下調(diào)，lncRNA SOX2OT表達上調(diào)，并均與NSCLC患者臨床分期相關。本研究結果顯示，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平均與腫瘤的病理組織學類型顯著相關，腺癌患者中二者表達水平明顯高于鱗癌患者，而與患者其他臨床病理特征均無明顯相關性。其原因可能由于入選病例的各個臨床分期、各種組織學類型及有無淋巴結轉(zhuǎn)移的患者比例不同，以及檢測lncRNA表達的樣本類型不同。此外，血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表達水平與NSCLC患者臨床分期無明顯相關性，表明早期(Ⅰ～Ⅱ期)和中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)NSCLC的血漿lncRNAs水平有相似的增高，提示二者對早期NSCLC的診斷效能與中晚期NSCLC相似。

綜上所述，本研究顯示血漿lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT可作為生物標志物用于NSCLC的診斷，二者與血清癌胚抗原聯(lián)合檢測能夠獲得較高的診斷敏感性和特異性。