顏駿， 張浩， 王好， 陶艾彬， 姚永偉， 張國(guó)輝， 芮濤

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

臨床上膿毒癥并發(fā)心功能障礙的發(fā)病率高且死亡率高[1]。但是膿毒癥引起心功能損傷的機(jī)制尚不清楚，也欠缺有效的針對(duì)性治療。

有文獻(xiàn)報(bào)道，白介素(IL)-1β與膿毒癥心肌功能損傷相關(guān)[2]，IL-1β的生成和調(diào)控與炎癥小體相關(guān)。炎癥小體是一類(lèi)存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合體，能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原相關(guān)分子模式(PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)等，通過(guò)介導(dǎo)IL-1β和IL-18的生成，調(diào)控炎癥相關(guān)基因表達(dá)等方式產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體可對(duì)多種物理、化學(xué)刺激做出反應(yīng)，如活性氧(ROS)、外源性三磷酸腺苷(ATP)等[5-6]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1前體組成。NLRP3小體有多種活化途徑，經(jīng)典的為雙信號(hào)途徑，分為引發(fā)和激活兩個(gè)階段。引發(fā)階段胞質(zhì)內(nèi)的NLRP3和IL-1β前體的合成增多，激活階段通過(guò)活化的caspase-1進(jìn)一步生成IL-1β和IL-18，發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。

目前影響NLRP3炎癥小體激活的因素尚未完全明確。我們之前的研究顯示，使用脂多糖刺激6 h，可使心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)NLRP3、pro-IL-1蛋白合成增多，再使用ATP刺激30 min，可激活NLRP3炎癥小體，產(chǎn)生IL-1β和IL-18。并通過(guò)“細(xì)胞交互作用”與高遷移率族蛋白B1聯(lián)合作用，引起心肌細(xì)胞收縮功能減弱[8]。本研究使用線粒體活性氧(mtROS)靶向清除劑mito-TEMPO減少炎癥小體激活階段心肌成纖維細(xì)胞胞內(nèi)mtROS的表達(dá)，探討mtROS在心肌成纖維細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C57BL/6小鼠購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇)2013—0011。IL-1β鼠抗體、NLRP3兔抗體、ASC兔抗體、脂多糖、ATP(Cell Signaling Technology公司)；caspase-1鼠抗體(Novus Biologicals公司)；兔多克隆β-肌動(dòng)蛋白抗體、羊抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司)；羊抗鼠IgG抗體(美國(guó)Bio-world公司)； mito-TEMPO、Hoechst 33342、膠原酶、中性蛋白酶(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；培養(yǎng)基DMEM/F12(維森特生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(ExCell Bio公司)；測(cè)定IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國(guó)RδD Systems公司)；MitoSOX(美國(guó)Thermo Fisher公司)；細(xì)胞裂解液、蛋白A/G瓊脂糖珠、蛋白酶抑制劑混合物、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；其他試劑都為化學(xué)分析純。

1.2 小鼠成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取3～4周雌雄不限的C57BL/6小鼠6只，以斷頸法處死，于超凈工作臺(tái)在無(wú)菌條件下取出心臟，將心臟在冷D-Hanks液中切割為約1 mm3的組織小塊后，浸沒(méi)于膠原酶(0.002 g/mL)和中性蛋白酶(0.001 g/mL)中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱緩慢振蕩45 min，取上清液1 500 r/min離心5 min，去除上清液后加入含10%胎牛血清的DMEM到培養(yǎng)皿中。如此反復(fù)2～3次，收集所得細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3 h后去除未貼壁細(xì)胞懸液，剩余貼壁細(xì)胞每日更換培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)72 h可用于實(shí)驗(yàn)[9]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞分為4組處理。引發(fā)組：加入含0.001 ng/L脂多糖的培養(yǎng)基處理6.5 h；激活組：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培養(yǎng)基，6 h后加入3 mmol/L的 ATP，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h[10]；干預(yù)組：先加入含0.001 ng/L脂多糖的培養(yǎng)基，5.5 h后加入25 μmol/L的mito-TEMPO[11]，0.5 h后再加入3 mmol/L的ATP，維持0.5 h；對(duì)照組：加入常規(guī)培養(yǎng)基6.5 h后，添加與干預(yù)組試劑等量的D-Hanks液。

1.4 MitoSOX染色觀察小鼠心肌成纖維細(xì)胞mtROS表達(dá)

將處理好的各組心肌成纖維細(xì)胞去除培養(yǎng)基后，使用D-Hanks液洗滌3次，加入5 μmol/L的MitoSOX，37 ℃避光孵育10 min[12]，去除染液并再次清洗后，加入0.001 μg/L的Hoechst 33342染液37 ℃避光孵育10 min，去除染液并再次清洗后在熒光顯微鏡(Zeiss LSM880, 美國(guó))下觀察、拍照。胞質(zhì)中mtROS呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，每組觀察10個(gè)細(xì)胞，通過(guò)Image J軟件分析熒光強(qiáng)度數(shù)值后取平均值，重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞Pro-IL-1β、ASC、NLRP3、Pro-caspase-1蛋白表達(dá)

收集4組細(xì)胞提取蛋白，取10 μL樣品由10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別使用一抗IL-1β(1 ∶1 000)、ASC(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、caspase-1(1 ∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)、羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)室溫孵育2 h。Bio-Rad曝光儀攝像，以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，Image J軟件分析灰度值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和caspase-1 p20蛋白表達(dá)

分別收集4組細(xì)胞上清液，將上清液與無(wú)水甲醇、氯仿混合，4 ℃以15 000×g離心15 min，去除上清液，加入無(wú)水甲醇800 μL，再4 ℃以15 000×g離心15 min，去除上清液后得到所需提取蛋白。所提取蛋白通過(guò)蛋白印跡法分別檢測(cè)caspase-1 p20、IL-1β蛋白表達(dá)。

1.7 ELISA法檢測(cè)小鼠心肌成纖維細(xì)胞上清液中IL-1β蛋白含量

將4組細(xì)胞上清液各50 μL加入微孔板室溫孵育2 h，洗滌后加入100 μL酶標(biāo)檢測(cè)抗體室溫孵育2 h，再次洗滌后加入顯色劑混合物100 μL室溫孵育30 min。加入終止液100 μL，30 min內(nèi)使用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)量450 nm的光密度值，設(shè)置540 nm作為校正波長(zhǎng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組標(biāo)本中IL-1β蛋白含量。

1.8 免疫共沉淀法檢測(cè)與ASC結(jié)合的NLRP3及Pro-caspase-1蛋白的表達(dá)

心肌成纖維細(xì)胞用混合有蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解后，15 000×g，4 ℃離心15 min，收集上清液。將蛋白A/G瓊脂糖珠與上清液混合，4 ℃搖晃20 min；再以4 ℃，12 000 r/min離心15 min，所得上清液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將兔抗ASC單克隆抗體(31 μg)加入到含500 μg總蛋白的上清液中，將所得混合物在4 ℃以4 000×g離心5 min，去上清液，將上樣緩沖液加入到瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物中。將混合物煮5 min，取上清液行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用針對(duì)小鼠ASC、NLRP3和Pro-caspase-1蛋白的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌成纖維細(xì)胞mtROS比較

如圖1所示，小鼠心肌成纖維細(xì)胞受脂多糖和ATP刺激后，mtROS水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；使用mito-TEMPO干預(yù)后，mtROS水平較激活組明顯下降(P<0.05)，但仍明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

n=3； #：P<0.05，與對(duì)照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖1 mitoSOX染色觀察小鼠心肌成纖維細(xì)胞mtROS水平

2.2 各組心肌成纖維細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖2所示，心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3和Pro-IL-1β蛋白較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而Pro-caspase-1、ASC的表達(dá)無(wú)明顯變化；經(jīng)ATP激活和mito-TEMPO干預(yù)后，干預(yù)組中Pro-IL-1β較激活組升高(P<0.05)。

使用ATP激活NLRP3炎癥小體，上清液中caspase-1 p20和IL-1β較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而干預(yù)組使用mito-TEMPO降低mtROS后使caspase-1 p20和IL-1β較激活組明顯減少(P<0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，激活組上清液中IL-1β含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，干預(yù)組上清液中IL-1β含量較激活組明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.3 各組心肌成纖維細(xì)胞中NLRP3、Pro-caspase-1與ASC結(jié)合情況

免疫共沉淀法檢測(cè)可見(jiàn)，經(jīng)脂多糖和ATP刺激后，心肌成纖維細(xì)胞中NLRP3-ASC連接形成復(fù)合體，干預(yù)組NLRP3和ASC的結(jié)合減少。而Pro-caspase-1蛋白不受影響。見(jiàn)圖4。

① 對(duì)照組； ② 引發(fā)組； ③ 激活組； ④ 干預(yù)組n=3； #：P<0.05，與對(duì)照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖2 各組心肌成纖維細(xì)胞胞內(nèi)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)

① 對(duì)照組； ② 引發(fā)組； ③ 激活組； ④ 干預(yù)組n=3； #：P<0.05，與對(duì)照組比較；*：P<0.05，與激活組比較圖3 各組心肌成纖維細(xì)胞上清液中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4 免疫共沉淀法檢測(cè)各組心肌成纖維細(xì)胞NLRP3和ASC的結(jié)合

3 討論

IL-1β的生成增加是膿毒癥引發(fā)心肌收縮力下降和膿毒癥休克的重要因素[13]，IL-1β的生成、成熟、分泌受NLRP3炎癥小體激活的調(diào)節(jié)[14]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥可導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活[8, 10]，來(lái)自心肌成纖維細(xì)胞的IL-1β經(jīng)心肌成纖維細(xì)胞-心肌細(xì)胞相互作用，引起膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心肌功能障礙。在本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)脂多糖可引起心肌成纖維細(xì)胞中mtROS生成增加，mtROS增加又通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NLRP3和ASC蛋白的結(jié)合激活NLRP3炎癥小體，而通過(guò)減少激活階段的mtROS可抑制NLRP3炎癥小體的激活和心肌成纖維細(xì)胞分泌IL-1β。

NLRP3炎癥小體為細(xì)胞內(nèi)的多蛋白平臺(tái)，其激活經(jīng)引發(fā)和激活兩個(gè)階段。在引發(fā)階段，刺激因素通過(guò)NF-κB途徑，增加了細(xì)胞內(nèi)Pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平，但并不會(huì)影響ASC和Pro-caspase-1的細(xì)胞內(nèi)水平。而激活階段，刺激物引發(fā)NLRP3蛋白的NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身寡聚化，從而連接蛋白ASC與Pro-caspase-1，引發(fā)相互作用。NLRP3炎癥小體復(fù)合物通過(guò)切割Pro-caspase-1使其活化，活化的caspase-1再將Pro-IL-1β和Pro-IL-18切割，引起IL-1β和IL-18成熟和釋放[7]。我們的研究結(jié)果表明，在膿毒癥中mtROS在NLRP3炎癥小體激活中起到關(guān)鍵作用，其通過(guò)促進(jìn)NLRP3蛋白和ASC蛋白的結(jié)合引發(fā)NLRP3炎癥小體的激活。而在激活階段使用mito-TEMPO可有效降低細(xì)胞內(nèi)mtROS的含量，從而可進(jìn)一步抑制炎癥小體的激活。

但本研究尚不能確定mtROS是通過(guò)何種方式來(lái)促進(jìn)NLRP3-ASC蛋白連接，或是否存在其他途徑促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活。本研究結(jié)果表明mtROS在心肌成纖維細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活中起到重要作用，可能是治療膿毒癥誘發(fā)的心肌功能障礙的潛在靶點(diǎn)。