凌薇， 宋玉潔， 汪慧， 朱昱蓉， 袁琳， 馬雨潤， 程芳， 姜旭淦， 陳盛霞

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種可以感染所有溫血?jiǎng)游锏膶Ｐ约?xì)胞內(nèi)寄生蟲，可引起人畜共患病弓形蟲病[1-2]。全球約有三分之一的人口感染剛地弓形蟲，大多數(shù)表現(xiàn)為隱性或無癥狀感染。弓形蟲感染常導(dǎo)致人類和動(dòng)物的先天性疾病和流產(chǎn)[3-4]。弓形蟲病常為艾滋病患者或其他免疫力嚴(yán)重低下人群的并發(fā)癥[2,5]。

外泌體(exsomes)是一種直徑為30～150 nm的納米級(jí)囊泡，通過多泡體與質(zhì)膜融合而分泌到細(xì)胞外。這些小囊泡含有多種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能[6-7]，還在物質(zhì)信息傳遞、細(xì)胞間通訊中起關(guān)鍵作用[8-9]。根據(jù)外泌體的來源和大小，已有5種外泌體分離技術(shù)，分別是超高速離心技術(shù)、基于尺寸的分離技術(shù)、聚合物沉淀技術(shù)、免疫親和捕獲技術(shù)和最近發(fā)展的微流體衍生技術(shù)，并在聚合物沉淀技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)出更加成熟的外泌體提取試劑盒[10]。外泌體的特征可以通過其大小、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量來描述，也可以通過檢測(cè)其形態(tài)特征、粒徑和表面標(biāo)志來鑒別[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲的外泌體或微囊泡能夠作用于宿主細(xì)胞，調(diào)控宿主細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫反應(yīng)，參與寄生蟲致病過程[12]。其中，研究較多的有利什曼原蟲、錐蟲、惡性瘧原蟲和陰道毛滴蟲等[7]；而對(duì)于弓形蟲的研究相對(duì)較少[13]，并且弓形蟲生活史復(fù)雜及蟲株多樣，給弓形蟲外泌體研究造成了一定的困難。本研究探討弓形蟲RH株速殖子與細(xì)胞共培養(yǎng)條件下外泌體的分離和鑒定，為弓形蟲外泌體的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、細(xì)胞株、主要試劑

弓形蟲RH株速殖子和人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株由本課題組液氮保存。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(以色列BI公司)，CD63和HSP70抗體(美國Proteintech公司)，表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)、棒狀體蛋白16(rhoptry protein 16，ROP16)、ROP18、致密顆粒蛋白1(dense granule protein 1，GRA1)兔多克隆抗體由本課題組制備[14-17]，羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，0.22 μm濾器、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液和15 mL 100 000濃縮柱(美國Millipore公司)，外泌體提取試劑(美國System Biosciences公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及上清液收集

將胎牛血清經(jīng)4 ℃、100 000×g離心16 h，收集上層1/3液體，并通過0.22 μm濾器過濾除菌，制備成除外泌體胎牛血清。常規(guī)復(fù)蘇SW480細(xì)胞，用含有10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基于T25培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)SW480細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入含1%除外泌體胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液(此為細(xì)胞培養(yǎng)上清液)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 弓形蟲與細(xì)胞共培養(yǎng)上清液及速殖子蛋白制備

常規(guī)復(fù)蘇弓形蟲RH株速殖子，參照文獻(xiàn)[18]方法在SW480細(xì)胞中連續(xù)傳代獲得弓形蟲速殖子；在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，換成含1%除外泌體胎牛血清培養(yǎng)基，接種5×106個(gè)弓形蟲速殖子繼續(xù)培養(yǎng)；每隔8 h于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞和蟲體生長情況；24 h可見蟲體假包囊形成，3～4 d內(nèi)細(xì)胞全部被脹破，速殖子游離在培養(yǎng)基中。收集此時(shí)的培養(yǎng)物， 3 200×g離心10 min，上清液即為弓形蟲與細(xì)胞共培養(yǎng)上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在上述共培養(yǎng)沉淀中加入1×PBS重懸，300×g離心5 min，吸取上清液，再重復(fù)上述操作2次。上清液經(jīng)3 200×g離心10 min，沉淀重懸于1×PBS中，凍融3次。加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)，在冰上以60 W/s超聲2 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液。用Bradford法測(cè)定蛋白含量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外泌體分離

將收集的弓形蟲速殖子與細(xì)胞共培養(yǎng)上清液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液于4 ℃下分別經(jīng)300×g離心10 min，收集上清液，再經(jīng)2 000×g離心20 min；繼續(xù)收集上清液，經(jīng)10 000×g離心30 min。吸取上清液，加入15 mL 100 000濃縮柱，4 ℃、1 000×g離心30 min，吸取濃縮液體；濃縮液通過0.22 μm濾器除菌，以5 ∶1比例加入外泌體提取試劑，4 ℃過夜；4 ℃、1 500×g離心30 min，管底可見淡黃色至白色沉淀，吸棄上清液；4 ℃、1 500×g再離心5 min，吸棄殘留上清液，以1 ∶1比例加入1×PBS溶解沉淀(此為外泌體)，分裝后-80 ℃保存。

1.5 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)

用移液器吸取50 μL外泌體懸液于潔凈載玻片上，將載樣銅網(wǎng)倒扣于懸液上，注意區(qū)分銅網(wǎng)正反面，室溫靜置3 min，自然干燥；滴加2%磷鎢酸復(fù)染3 min，濾紙吸干殘留液，白熾燈下烤10 min，透射電鏡觀察拍照。

1.6 納米粒子跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體大小

用1×PBS緩沖液稀釋分離的外泌體樣品，使用ZetaView PMX 110儀器及其相應(yīng)的ZetaView 8.04.02軟件對(duì)稀釋后的樣本進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)以測(cè)量外泌體的粒徑和濃度；實(shí)驗(yàn)中，在11個(gè)位置記錄和分析NAT測(cè)量值，以110 nm聚苯乙烯顆粒校準(zhǔn)ZataView系統(tǒng)，溫度保持在23 ℃～27 ℃。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白和弓形蟲特異蛋白

將外泌體樣本、弓形蟲蛋白樣本分別與上樣緩沖液混勻，100 ℃水中煮10 min備用。樣本分別用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以80 V恒壓電泳120 min，300 mA恒流轉(zhuǎn)印90 min，使蛋白轉(zhuǎn)至預(yù)先經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上。用含5%的脫脂奶粉TBST室溫封閉2 h，分別加入CD63抗體(1 ∶500)、HSP70抗體(1 ∶500)、SAG1抗體(1 ∶100)、ROP16抗體(1 ∶100)、ROP18抗體(1 ∶100)、GRA1抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜3次，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色并拍照。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲外泌體超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡結(jié)果顯示，弓形蟲外泌體呈圓形或橢圓形的囊泡樣，囊泡外周可見膜性結(jié)構(gòu)，大小具有異質(zhì)性，直徑為30～150 nm，腔內(nèi)部顯示低電子密度成分，背景清晰，無污染(圖1)。

圖1 弓形蟲外泌體透射電鏡觀察

2.2 弓形蟲外泌體粒徑分析結(jié)果

分離獲得的外泌體3 000倍稀釋，利用NTA技術(shù)檢測(cè)外泌體的粒徑大小。結(jié)果顯示，弓形蟲外泌體平均粒徑大小為119.5 nm(圖2A)；直徑大多在30～150 nm，占總數(shù)的87.8%(圖2B)。

A：外泌體粒徑大小分布；B：外泌體粒徑大小百分比

圖2 弓形蟲外泌體納米粒徑分析

2.3 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

弓形蟲外泌體與SW480細(xì)胞外泌體均有CD63和HSP70蛋白的表達(dá)(圖3A)。弓形蟲分泌蛋白SAG1、ROP16、ROP18、GRA1檢測(cè)結(jié)果顯示，弓形蟲外泌體與弓形蟲速殖子中均有這些蛋白表達(dá)，而在SW480細(xì)胞外泌體中卻未檢測(cè)到(圖3B)。

A：外泌體標(biāo)志蛋白；B：弓形蟲特異蛋白圖3 弓形蟲外泌體標(biāo)志蛋白和弓形蟲特異蛋白分析

3 討論

有研究報(bào)道采用體外單獨(dú)培養(yǎng)方法，收集弓形蟲培養(yǎng)上清液，可分離弓形蟲速殖子外泌體[13, 19]。本研究早期也采用這個(gè)方法，但分離的外泌體濃度低，原因可能是經(jīng)3 μm濾膜純化時(shí)，速殖子受外力擠壓、破壞，離開細(xì)胞時(shí)間過長，蟲體活力降低，外泌體的分泌減少。本研究用蟲體與細(xì)胞共培養(yǎng)[20]，收集從蟲體侵入細(xì)胞開始到細(xì)胞破裂、蟲體游離整個(gè)過程的培養(yǎng)上清液，蟲體增殖旺盛，分泌較多外泌體；而且這種方法更接近蟲體與宿主細(xì)胞作用的自然狀態(tài)，后續(xù)研究更能揭示蟲體外泌體的真實(shí)作用。盡管分離的外泌體中存在少量細(xì)胞分泌的外泌體，但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以細(xì)胞培養(yǎng)上清液分離的外泌體作為對(duì)照，即可消除共培養(yǎng)細(xì)胞外泌體的干擾作用。

外泌體分離方法中最常用的是試劑盒法和超速離心法。超速離心法是經(jīng)典分離方法，是分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)[21]，操作簡單，適合大體積樣本的分離，不適用于微量及珍貴樣本的研究。Linares等[22]報(bào)道，超速離心會(huì)造成外泌體損失，使外泌體易聚集，降低外泌體的質(zhì)量及產(chǎn)量，破壞囊泡的完整性，進(jìn)而影響下游分析。試劑盒法是基于聚合物沉淀技術(shù)、實(shí)現(xiàn)外泌體快速分離純化的分離方法，操作簡單，無需特殊的技術(shù)及設(shè)備。Tang等[23]報(bào)道，與超速離心法相比，試劑盒法分離的外泌體回收率更高，可用于下游分析試驗(yàn)，但其易受其他非外泌體污染，導(dǎo)致外泌體純度降低。本研究在試劑盒法的基礎(chǔ)上，通過多次離心、濃縮、過濾等操作，成功從細(xì)胞與速殖子共培養(yǎng)上清液中分離出外泌體，從而保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

本研究根據(jù)Li等[13]報(bào)道的弓形蟲外泌體鑒定方法，通過透射電鏡、NTA及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)對(duì)分離的外泌體超微結(jié)構(gòu)、粒徑大小、表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離的外泌體呈圓形或橢圓形的囊泡樣，囊泡外周可見膜性結(jié)構(gòu)，粒徑范圍為30～150 nm，含有外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63、HSP70和弓形蟲特異蛋白SAG1蛋白，從而確定弓形蟲外泌體分離成功。Li等[13, 24]研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲釋放的外泌體能夠激活巨噬細(xì)胞，刺激促炎因子分泌，觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)，對(duì)弓形蟲感染有局部保護(hù)作用。本研究嘗試檢測(cè)速殖子其他重要蛋白，結(jié)果顯示弓形蟲外泌體含有蟲體分泌蛋白R(shí)OP16、ROP18、GRA1。這些蛋白是由弓形蟲速殖子細(xì)胞器(如棒狀體、致密顆粒和微線體等)分泌，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。這些蛋白的檢出表明，外泌體可能作為弓形蟲分泌蛋白排出細(xì)胞的一種途徑，參與弓形蟲的致病、免疫調(diào)節(jié)等過程。因此，進(jìn)一步研究弓形蟲外泌體的蛋白或酶等其他組分，分析其在弓形蟲感染中的作用，可為弓形蟲與宿主相互作用及其機(jī)制的研究提供新思路。