丁超， 董利陽， 鄭婷婷， 劉佳夢， 康萍， 張助， 毛朝明

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是一種源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率約占所有甲狀腺癌的80%[1]。目前PTC的治療方式主要包括外科手術(shù)、甲狀腺激素以及放射性碘，然而PTC患者的復(fù)發(fā)率仍呈逐年上升趨勢[2]。研究表明，腫瘤內(nèi)血管的形成與PTC的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)密切正相關(guān)[3],而抑制腫瘤新生血管的形成已成為腫瘤治療的焦點。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有自我更新和多向分化能力的成體干細胞[4]。有研究指出，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞受骨髓來源的MSCs作用后，其分泌物可以顯著抑制內(nèi)皮細胞血管的形成[5]，提示MSCs有著抑制腫瘤內(nèi)血管形成的能力。而目前，MSCs對PTC誘導(dǎo)的血管形成有無影響仍不明確。本研究擬用人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord MSCs, hUCMSCs)培養(yǎng)上清液(hUCMSC-CM)刺激PTC細胞系TPC-1，觀察hUCMSC-CM對TPC-1細胞誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)血管形成能力的影響，旨在為PTC的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

hUCMSCs的提取參考本課題組前期報道[6]。TPC-1、HUVEC購自上海生物化學(xué)與細胞研究所；hUCMSCs培養(yǎng)基(蘇州賽業(yè)公司)；胎牛血清、青霉素、鏈霉素及DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Matrigel基質(zhì)膠、抗人CD73 PE、抗人CD90 PE、抗人CD14 PE、抗人CD19 PE(美國BD公司)；RNA抽提試劑TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa公司)；實時定量PCR試劑(北京康潤誠業(yè)有限公司)；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人β-肌動蛋白抗體(美國CST公司)；ECL發(fā)光液、PVDF膜(美國Millipore公司)；人VEGF ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) TPC-1細胞及HUVEC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 IU/mL青霉素及100 μg/L鏈霉素)中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 hUCMSCs的鑒定 將P3代hUCMSCs(1×106個)置于15 mL離心管中，并分別加入CD90、CD73、CD14、CD19及小鼠抗人IgG(陰性對照)抗體。4 ℃條件下染色15 min，隨后用PBS洗滌2次。將洗滌后的hUCMSCs置于流式管中，并應(yīng)用流式細胞儀檢測抗體表達，使用FlowJo軟件對結(jié)果進行分析。使用hUCMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基(均購自蘇州賽業(yè)公司)分別對 hUCMSCs進行培養(yǎng)，21 d后，分別采用茜素紅染色、油紅O染色觀察其向骨、脂肪分化的能力，具體的操作方法參考蘇州賽業(yè)公司的實驗手冊。

1.2.3 hUCMSC-CM的收集 將hUCMSCs(P3-P7代)細胞種植于10 cm培養(yǎng)皿中，當細胞長至密度達到70%左右時，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后及時收取培養(yǎng)上清液于15 mL離心管，300×g離心5 min以去除細胞碎片，然后將上清液用0.22 μm濾器過濾，分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 hUCMSC-CM刺激TPC-1細胞 計數(shù)3×105個TPC-1細胞種于6孔板中，待細胞貼壁后吸出培養(yǎng)液，并分別更換為對照培養(yǎng)液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM繼續(xù)刺激24 h。24 h后，再次更換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別收集3組TPC-1細胞培養(yǎng)上清液于15 mL離心管中，300×g離心5 min以去除細胞碎片，然后將上清液用0.22 μm濾器過濾，用于后續(xù)實驗。

1.2.5 基質(zhì)膠小管形成實驗 實驗前24 h，將基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱中取出放于4 ℃冰箱充分融化，在96孔板中每孔加入50 μL基質(zhì)膠，將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置2 h，使其凝固。計數(shù)5×104個HUVEC細胞分別與步驟“1.2.4”中收集的TPC-1細胞培養(yǎng)上清液100 μL混合成細胞懸液，并加入含有基質(zhì)膠的96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔3 h在顯微鏡下進行觀察，當有明顯血管形成時立即進行拍照。使用Image J圖像分析軟件測量各組形成的小管總長度。并計算血管形成率，血管形成率(%)=實驗組長度/對照組長度×100%。

1.2.6 CCK-8法檢測TPC-1細胞的增殖 將TPC-1細胞接種于96孔板(3×103個/孔)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別加入對照培養(yǎng)液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM，在6 h、24 h、48 h時間點，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(D)值。

1.2.7 實時定量PCR檢測TPC-1細胞中VEGFmRNA的表達 收集對照培養(yǎng)液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM處理24 h后的TPC-1細胞，TRIzol法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作獲取cDNA。以β-肌動蛋白為內(nèi)參、cDNA為模板，實時定量PCR定量檢測各組TPC-1細胞中VEGFmRNA表達。PCR驗證引物購自廣州富能基因有限公司(產(chǎn)品貨號VEGF：HQP117835；β-肌動蛋白：HQP016381)。PCR反應(yīng)體系10 μL：cDNA 4 μL、引物1 μL(終濃度為2 μmol/L)、2×Taq預(yù)混反應(yīng)試劑5 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，40個循環(huán)?；虮磉_量以2-ΔΔCt表示，實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡檢測TPC-1細胞VEGF的表達 收集對照培養(yǎng)液、20% hUCMSC-CM、40% hUCMSC-CM處理24 h后的TPC-1細胞，加入蛋白裂解液RIPA，充分振蕩混勻后置于冰上，每10 min重復(fù)振蕩1次，重復(fù)3次。隨后12 000×g離心15 min，取上清液，應(yīng)用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。接著加入上清液體積1/4的5×上樣緩沖液，充分混勻后置于金屬浴中95 ℃ 10 min熱變性后分裝至-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白加至10%聚丙烯酰胺膠中電泳，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將PVDF膜取出后用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，并分別加入兔抗人β-肌動蛋白(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人VEGF抗體(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。隨后加入HPR標記的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL曝光顯影。

1.2.9 ELISA檢測TPC-1細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量 取步驟“1.2.4”中TPC-1細胞的培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，每孔加入50 μL樣本稀釋液，再加入200 μL標準品或待測樣品，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃孵育120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌3次，在濾紙上印干。每孔中加入200 μL酶標抗體工作液，將反應(yīng)板置37 ℃孵育120 min。再次洗板并印干，每孔加入200 μL底物工作液，置37 ℃暗處反應(yīng)120 min。每孔加入50 μL終止液，30 min內(nèi)用酶標儀在450 nm處測D值。根據(jù)標準品D值繪制標準曲線，計算出待測樣品中VEGF含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見hUCMSCs(P3代)大小一致，呈長梭形，并以“漩渦狀”排列生長。經(jīng)成骨或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)3周后，分別用茜素紅和油紅O染色，可見橘紅色鈣化物和紅色脂滴，表明這種梭形細胞有著向成骨和脂肪分化的能力。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，細胞表面CD73和CD90陽性率大于95%，而CD14和CD19陽性率小于2%。這些結(jié)果符合國際細胞治療學(xué)會對MSCs的定義，提示hUCMSCs提取成功。見圖1。

2.2 hUCMSC-CM作用后的TPC-1細胞培養(yǎng)上清液抑制HUVEC血管形成

基質(zhì)膠小管形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞培養(yǎng)上清液可顯著抑制HUVEC形成管狀結(jié)構(gòu)(F=83.25，P<0.001)。表明hUCMSC-CM顯著抑制了TPC-1細胞誘導(dǎo)HUVEC血管形成的能力。見圖2。

2.3 hUCMSC-CM抑制TPC-1細胞的增殖

CCK-8法結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞在24 h(F=18.35，P<0.01)和48 h(F=18.58，P<0.01)的增殖能力均顯著降低。見圖3。

2.4 hUCMSC-CM抑制TPC-1細胞中VEGF的表達及分泌

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)hUCMSC-CM刺激后，TPC-1細胞中VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(F=169.5，P<0.001)。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，hUCMSC-CM可明顯下調(diào)TPC-1細胞中VEGF蛋白的表達水平(F=217.5，P<0.001)。ELISA分析結(jié)果顯示，hUCMSC-CM處理后，TPC-1細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量明顯降低(F=21.38，P<0.05)。見圖4。

A：hUCMSCs的形態(tài)(100×)；B：hUCMSCs的成骨誘導(dǎo)(100×)；C：hUCMSCs的成脂誘導(dǎo)(100×)；D：hUCMSCs的表面標志

圖1 hUCMSC的鑒定

A：各組血管內(nèi)皮細胞形成的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(100×)；B：血管形成率圖2 基質(zhì)膠小管形成實驗檢測HUVEC血管形成能力

圖3 CCK-8法檢測TPC-1細胞的增殖

A：實時熒光定量PCR；B:蛋白質(zhì)印跡；C：VEGF蛋白相對表達量；D：ELISA圖4 hUCMSC-CM作用后TPC-1細胞中VEGF的表達及分泌的變化

3 討論

MSCs是一種源于發(fā)育早期中胚層的具有多種分化潛能和自我更新能力的成體干細胞，可來源于多種組織，包括骨髓、脂肪、臍帶、甲狀腺、月經(jīng)血等[4]。而在眾多MSCs來源的組織當中，人臍帶容易獲得、不違背倫理且hUCMSCs具有易提取、易體外培養(yǎng)、低免疫原性等優(yōu)勢，hUCMSCs成為了MSCs領(lǐng)域的研究焦點[7-8]，甚至多個國家已成立hUCMSCs細胞庫用于臨床疾病的防治[9]。本研究選用hUCMSCs為研究對象，通過細胞形態(tài)的觀察、成骨成脂分化潛能的測定以及流式標志的檢測，進一步證實hUCMSCs提取的可靠性。

腫瘤內(nèi)血管的形成是腫瘤得以發(fā)生發(fā)展的重要保證，是腫瘤營養(yǎng)的主要供給。因此切斷腫瘤營養(yǎng)供給成為腫瘤治療的熱點之一[10]。腫瘤細胞在生長過程中可分泌多種促血管生成的因子(如VEGF)以促進腫瘤新生毛細血管的形成[11]，而抑制腫瘤細胞分泌這些促血管生成因子可有效地抑制腫瘤的進展[12]?；贛SCs有著向腫瘤部位趨化的特性，MSCs與腫瘤的關(guān)系成為近些年研究的焦點，而MSCs與腫瘤血管形成的報道也日益增多。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的MSCs和胃癌細胞混合并接種于裸鼠皮下后，腫瘤生長加速，且MSCs可以顯著促使瘤體內(nèi)新生血管的形成。然而，Otsu等[14]發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的MSC和黑色素瘤混合并注入裸鼠皮下后，瘤體生長受抑，且瘤內(nèi)血管密度降低。此外還有研究指出，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞受骨髓來源的MSCs作用后，其分泌物可以顯著抑制內(nèi)皮細胞血管的形成[5]。這種MSCs對腫瘤血管生成結(jié)果的差異可能與MSCs的來源、腫瘤的類型等不同有關(guān)[15]。然而，MSCs對PTC誘導(dǎo)的血管生成有無影響目前尚未見報道。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)hUCMSC-CM刺激后的TPC-1細胞培養(yǎng)上清液可顯著抑制HUVEC血管的形成。同時hUCMSC-CM可以顯著抑制TPC-1細胞的增殖。這些結(jié)果提示hUCMSC-CM對TPC-1細胞有著直接和間接的抑制效應(yīng)。而hUCMSC-CM對TPC-1細胞的其他生物學(xué)效應(yīng)(如凋亡、侵襲等)是否有影響以及其是否可在體內(nèi)抑制PTC的生長尚需進一步探究。

VEGF是腫瘤細胞分泌的血管形成最強烈的刺激因子，在血管發(fā)生和形成過程中起著重要的正向調(diào)控作用[16]。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs的外泌體可抑制乳腺癌細胞VEGF的表達，而受MSCs作用后的乳腺癌細胞，其培養(yǎng)上清液可顯著抑制HUVEC的血管形成。相似的是，本研究結(jié)果顯示hUCMSC-CM可以顯著抑制TPC-1細胞中VEGFmRNA和蛋白的表達，且顯著減少了TPC-1細胞VEGF的分泌。這些結(jié)果提示hUCMSCs抑制TPC-1誘導(dǎo)HUVEC血管生成的機制可能源于對TPC-1細胞中VEGF表達的負調(diào)控。而hUCMSC-CM調(diào)控TPC-1中VEGF表達的潛在機制需要進一步探究。

綜上所述，hUCMSC-CM可顯著抑制TPC-1細胞誘導(dǎo)HUVEC血管形成的能力，這種作用機制可能源于對TPC-1細胞中VEGF表達的抑制。這可能為PTC的干預(yù)治療提供新的策略。