施辰， 曹海霞， 徐陳欣， 張輝， 婁芮, 吳建中， 馬蓉， 馮繼鋒

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科， 江蘇 南京 210009； 2. 江蘇省腫瘤醫(yī)院臨床腫瘤研究中心， 江蘇 南京 210009)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤[1]。根據(jù)組織病理學(xué)分類，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中肺腺癌是NSCLC最主要的亞型之一，約占所有肺癌病例的40%[2]。NSCLC生長迅速，轉(zhuǎn)移早，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬進(jìn)展期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。目前，含鉑的雙藥聯(lián)合化療仍然是臨床上治療NSCLC的一線標(biāo)準(zhǔn)方案。鉑類化合物是一類非特異性細(xì)胞周期抗腫瘤藥物，具有廣泛的抗瘤譜，主要包括順鉑(cisplatin, DDP)，奈達(dá)鉑(nedaplatin, NDP)，卡鉑(carboplatin，CBP)，奧沙利鉑(Oxaliplatin, OXA)等[3]。這類藥物的作用機(jī)制相似，主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷、抑制修復(fù)，進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡[4]。然而，隨著此類藥物的普遍應(yīng)用，致使癌細(xì)胞不可避免地對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性，嚴(yán)重降低肺癌的治愈率和遠(yuǎn)期生存率[5]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼序列，由于缺乏開放閱讀框架，不具備編碼蛋白的能力[6]。研究表明，在癌組織和細(xì)胞中頻繁出現(xiàn)lncRNA異常表達(dá)的情況，它們可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物抵抗有密不可分的相關(guān)性[7]。然而，lncRNA引起肺腺癌鉑類耐藥的機(jī)制尚不完全清楚。本研究利用人肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞 (A549/DDP和A549/NDP)及其親代敏感細(xì)胞A549細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA的芯片表達(dá)譜分析，篩選出lncRNA PAPPA-AS1作為研究對(duì)象，探討其在肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞中的作用以及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，其鉑類耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP和A549/NDP均由江蘇省腫瘤醫(yī)院臨床腫瘤研究中心誘導(dǎo)構(gòu)建并且傳代培養(yǎng)。為維持耐藥株的狀態(tài)，在A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入2.5 μmol/L DDP和NDP。所有細(xì)胞置于5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)液。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(南京凱基生物科技有限公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，Trizol RNA抽提試劑、Lipofectamine RNA iMAX試劑(美國Invitrogen公司)，Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Qubit RNA分析試劑盒(美國Life Technologies公司)，NEBNext Ultra RNA試劑盒(美國NEB公司)，TruSeq PE聚類試劑盒(美國Illumina公司)，順鉑(美國Sigma-Aldrich公司)，奈達(dá)鉑(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，蛋白抗體(美國CST公司)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(-80℃)(美國Thermo公司)，恒溫水浴鍋(太倉市科教器材廠)，7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Epoch Bio Tek公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio Rad公司)，納米分光光度計(jì)(美國Implen公司)。

1.3 RNA-Seq分析肺腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA以及mRNA的差異表達(dá)

RNA測序分析由中國上海嘉因生物科技公司完成。使用Trizol分離A549和鉑類耐藥細(xì)胞的總RNA。利用納米分光光度計(jì)檢測RNA純度。Qubit分析試劑盒測量RNA濃度。安捷倫RNA納米試劑盒檢測RNA的完整性?？偣? μg RNA/樣本作為輸入材料的RNA樣品制備。使用NEBNext Ultra RNA試劑盒生成測序文庫，并添加索引代碼來為每個(gè)樣本添加屬性序列。使用TruSeq PE聚類試劑盒對(duì)索引編碼的樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果生成后在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)上進(jìn)行RNA測序。

1.4 小干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞

PAPPA-AS1特異性小干擾序列(si-PAPPA-AS1)由中國廣州銳博科技有限公司合成。將10 μL iMAX加入250 μL的Opti-MEM中稀釋，吹打混勻后，室溫靜置5 min,按照iMAX試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48～72 h siRNA后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。siRNA的靶序列：5′-AATTCCCAGCTCCAGGTTTC-3′。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性

細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種到96孔板，分別加入濃度為3.3、6.6、13.2、19.8、26.4、33.0 μmol/L DDP或5、10、20、30、40、50 μmol/L NDP的培養(yǎng)液。每個(gè)細(xì)胞株和藥物濃度設(shè)立6個(gè)復(fù)孔。48 h后加入CCK-8試劑孵育1～2 h，待培養(yǎng)液顏色明顯變黃后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的光密度(D) 值，計(jì)算各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測敲減PAPPA-AS1后耐藥細(xì)胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染后的鉑類耐藥細(xì)胞接種于96孔板，每孔內(nèi)加入細(xì)胞6 000個(gè)，放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)后的24、48、72、和96 h, 棄舊培養(yǎng)液，每孔加入含CCK-8試劑(10 μL)的100 μL培養(yǎng)液, 放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，待視覺顏色明顯變黃時(shí)，用酶標(biāo)儀測量450 nm處的D值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測敲減PAPPA-AS1后耐藥細(xì)胞的增殖活力

用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的鉑類耐藥細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸以備用。將細(xì)胞以每孔200個(gè)/孔均勻接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板中。置于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，每3天更換一次完全培養(yǎng)液。大約培養(yǎng)2周，每天觀察細(xì)胞，待細(xì)胞集落形成時(shí)，終止培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)液，PBS緩沖液潤洗2～3次。每孔加入適量多聚甲醛固定半小時(shí)，棄多聚甲醛，加入0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min。用PBS緩沖液洗去染色液，放于室內(nèi)通風(fēng)處自然干燥。拍照，計(jì)數(shù)。

1.8 qRT-PCR檢測lncRNAs在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況

按照TRIzol說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，采用PAPPA-AS1特異的引物進(jìn)行l(wèi)ncRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2× SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 4 μL，上下游引物(10 mol/L)各1 μL，無菌蒸餾水4 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、60℃退火34 s、68℃延伸45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RNA引物由中國廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)。PAPPA-AS1上游引物：5′-AGTGTGGTTCTGAGTGCAGTCTT-3′，下游引物：5′-TGGCAATCAGTGGTAGTAGGGA-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游引物：5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。通過公式2-△△CT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)分析敲減PAPPA-AS1后的細(xì)胞凋亡率

用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染后的耐藥細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次。采用Annexin V-熒光素異硫氰酸酯/碘化丙鈉(FITC/PI)進(jìn)行細(xì)胞染色, 室溫(20°C左右)避光放置15～20 min后檢測凋亡細(xì)胞。

1.10 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測敲減PAPPA-AS1后耐藥細(xì)胞中相關(guān)通路蛋白的表達(dá)

細(xì)胞在預(yù)冷的RIPA緩沖液中裂解完全，放入低溫離心機(jī)中4℃、12 000 r/min離心15 min。保留上清液，用BCA試劑盒測定濃度。置于70°C金屬浴上加熱10 min，將變性的蛋白樣品逐一加樣，電泳儀設(shè)置為220 V、60 min進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束取膠，300 mA轉(zhuǎn)膜。2 h后取出PVDF膜，浸于一抗Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p-PI3K、p-mTOR稀釋比均為1 ∶1 000，p-Akt稀釋比為1 ∶2 000，4℃孵育過夜。清洗后常溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h。利用ECL試劑盒配置顯影液，滴于PVDF膜上，暗室曝光，記錄蛋白圖片。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 人肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞株A549/DDP和A549/NDP的建立

采用大劑量沖擊法將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549連續(xù)暴露于劑量遞增的DDP或NDP中。經(jīng)過6個(gè)月的藥物誘導(dǎo)，鉑類耐藥細(xì)胞株A549/DDP和A549/NDP由親代A549細(xì)胞構(gòu)建成功。CCK-8檢測結(jié)果顯示，A549和A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的IC50值為(6.14±1.21)μmol/L和(38.49±1.32)μmol/L，A549和A549/NDP細(xì)胞對(duì)NDP的IC50值為(12.41±1.58)μmol/L和(54.74±1.97)μmol/L(圖1A、1B)。將肺腺癌細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，可見親代A549細(xì)胞呈上皮形態(tài)、圓球形、成簇生長，而A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞體積較大、形態(tài)拉長且不規(guī)則(圖1C、1D、1E)。

A、B: CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞在鉑類藥物作用下的生存活力；C～E：肺腺癌細(xì)胞的鏡下形態(tài)學(xué)觀察(×100)

圖1 鉑類耐藥細(xì)胞 A549/DDP和A549/NDP的建立

2.2 芯片中差異表達(dá)lncRNA的驗(yàn)證篩選

利用RNA-Seq對(duì)人肺腺癌親代敏感細(xì)胞株A549和順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP進(jìn)行l(wèi)ncRNA以及mRNA表達(dá)譜的分析。測序分析的聚類圖顯示了兩個(gè)細(xì)胞株之間差異表達(dá)的6 899個(gè)lncRNA和22 268個(gè)mRNA (圖2)。以倍數(shù)變化值>2和假發(fā)現(xiàn)率<0.05作為篩選顯著差異表達(dá)lncRNA和mRNA的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞中共有110個(gè)顯著差異表達(dá)的lncRNA，其中70例上調(diào)，40例下調(diào)。此外，耐藥細(xì)胞中有642個(gè)mRNA顯著上調(diào)，430個(gè)mRNA顯著下調(diào)。通過細(xì)胞生物學(xué)功能的KEGG通路分析，初步探討A549和A549/DDP細(xì)胞中差異表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，顯著上調(diào)的基因主要參與了p53信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)與受體的相互作用、局灶性黏附以及PI3K-Akt通路。相反，表達(dá)下調(diào)的mRNA所靶向富集的通路主要涉及唾液分泌、PPAR信號(hào)通路和不飽和脂肪酸的生物合成?；谝陨辖Y(jié)果，我們隨機(jī)選擇了其中顯著差異表達(dá)的6個(gè)lncRNA通過qRT-PCR驗(yàn)證其在A549/DDP細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平，以檢測芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。與親代A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞中CTD-2653D5.1、LINC01021、RP11-1151B14.4、PAPPA-AS1的表達(dá)水平升高，與測序結(jié)果一致。而MEG3、LINC00473的表達(dá)水平與親代細(xì)胞A549相比并無明顯差異。隨后，通過qRT-PCR檢測了這6個(gè)候選lncRNA在A549/NDP細(xì)胞中的相對(duì)于A549細(xì)胞的表達(dá)情況。最終，挑選出在兩株鉑類耐藥細(xì)胞中均明顯上調(diào)的lncRNA PAPPA-AS1進(jìn)行下一步的研究。

2.3 敲減PAPPA-AS1增強(qiáng)A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性

將小干擾序列si-PAPPA-AS1或si-NC轉(zhuǎn)染到A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞中，qRT-PCR結(jié)果顯示，si-PAPPA-AS1組中PAPPA-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)。測算DDP和NDP對(duì)轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞的IC50。結(jié)果顯示，PAPPA-AS1敲減后, A549/DDP和A549/NDP對(duì)DDP和NDP的IC50值分別為(7.85±1.27)μmol/L和(21.48±1.42)μmol/L，si-NC組的IC50值分別為(22.57±1.03)μmol/L和(45.27±1.38)μmol/L。見圖3。

2.4 敲減PAPPA-AS1抑制A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞的增殖

與si-NC組相比，si-PAPPA-AS1組細(xì)胞的增殖速率明顯降低。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)PAPPA-AS1的表達(dá)后，A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞增殖受到抑制，與si-NC組相比，形成的細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少。見圖4。

2.5 敲減PAPPA-AS1促進(jìn)A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，si-PAPPA-AS1組中的肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞的凋亡率較si-NC組顯著升高。蛋白印跡結(jié)果表明，PAPPA-AS1下調(diào)可促使A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)升高，磷酸化PI3K、Akt和mTOR的蛋白表達(dá)下調(diào)，而PI3K、Akt和mTOR蛋白表達(dá)無明顯變化。見圖5。

3 討論

肺腺癌是NSCLC中最常見的一種類型，化療是其臨床治療的重要手段之一[8]。臨床上以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療被認(rèn)為是NSCLC的一線治療方案。然而，隨著鉑類抗癌癥藥物的廣泛長期使用，有超過半數(shù)的腫瘤患者對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性[9]。耐藥性的產(chǎn)生是多因子網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的結(jié)果，至今臨床上仍然缺乏公認(rèn)的預(yù)測因子和基于分子機(jī)制的有效干預(yù)策略。因此，深入探究參與腫瘤耐藥性的基因及其作用機(jī)制對(duì)優(yōu)化肺癌的治療具有十分積極的意義。

A、B：lncRNA(A)和mRNA(B)差異表達(dá)的聚類熱圖分析,綠色代表下調(diào)的RNA;紅色代表上調(diào)的RNA；C: RT-qPCR驗(yàn)證lncRNA在鉑類耐藥細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)情況，*：P<0.05, 與A549細(xì)胞比較；D、E：差異表達(dá)mRNA的KEGG通路富集分析

圖2 肺腺癌細(xì)胞中顯著差異表達(dá)lncRNA篩選驗(yàn)證

圖3 敲減PAPPA-AS1增強(qiáng)A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性

*： P<0.01，與si-NC組比較圖4 敲減PAPPA-AS1抑制A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞的增殖

研究表明，lncRNA可以通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)從而參與腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成[10]。以lncRNA UCA1為例，其可通過促進(jìn)Wnt6的表達(dá)增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性[11]。然而，目前關(guān)于lncRNA與肺腺癌鉑類耐藥的報(bào)道較少。本研究通過RNA測序技術(shù)在肺腺癌細(xì)胞中篩選出了一種新的lncRNA PAPPA-AS1，它定位于染色體9q33.3，是一個(gè)長度為2 450 bp的反義lncRNA，有關(guān)它的生物學(xué)功能幾乎是未知的。與測序結(jié)果一致，與肺腺癌親代敏感A549細(xì)胞相比，PAPPA-AS1在A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞中均顯示出明顯的高表達(dá)，提示它可能與肺腺癌的鉑類耐藥密切相關(guān)。隨后，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能的體外研究，結(jié)果顯示敲減PAPPA-AS1可以增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)DDP以及NDP的敏感性，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 PAPPA-AS1下調(diào)對(duì)A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞凋亡的影響

PI3K/Akt信號(hào)通路是一條公認(rèn)的致癌通路，對(duì)細(xì)胞生長存活等過程至關(guān)重要[12]。研究證實(shí)，它的激活可以通過增加P53蛋白的降解而促進(jìn)癌細(xì)胞的存活，亦可通過抑制蛋白水解酶caspase-9的活性而阻止細(xì)胞凋亡[13-14]。近年來，有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路在A549/DDP細(xì)胞中被激活，而PI3K/Akt通路的失活可增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的化學(xué)敏感性[15]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PAPPA-AS1可降低A549/DDP和A549/NDP細(xì)胞中磷酸化PI3K、Akt和mTOR蛋白的表達(dá)水平，增加執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白Cleaved Caspase-9以及Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平。本研究數(shù)據(jù)說明，PAPPA-AS1下調(diào)可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞凋亡。然而，lncRNA PAPPA-AS1在化療耐藥中的具體機(jī)制還需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)PAPPA-AS1在肺腺癌鉑類耐藥細(xì)胞中呈高表達(dá)，它的下調(diào)可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的抵抗性。提示PAPPA-AS1可能作為一種促癌因子參與肺腺癌化療耐藥表型的形成，其有望成為逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥的生物學(xué)靶點(diǎn)。