陳宇斐， 周小荷， 李濤， 王超， 劉子瑤， 胡玉， 曹楊， 胡嘉波， 孫曉春

(江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

血管內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞通過細胞間直接接觸作用或自分泌、旁分泌生物因子，影響彼此發(fā)生發(fā)展[1]。胞外囊泡是直徑為30～1 000 nm的膜狀納米囊泡，由多種細胞類型分泌到細胞外環(huán)境中，是腫瘤微環(huán)境中細胞間交流的主要組分[2]。研究表明，胞外囊泡這種細胞通訊方式在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用[3]。以往關(guān)于內(nèi)皮細胞胞外囊泡的研究主要集中在對動脈粥樣硬化等心血管疾病的調(diào)控作用中[4]，但也有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞來源的胞外囊泡參與調(diào)節(jié)其他內(nèi)皮細胞的血管生成[5-6]和平滑肌細胞的動脈粥樣硬化保護。此外，血管內(nèi)皮細胞胞外囊泡參與多種類型腫瘤的進展過程，如鼻竇腸型腺癌、非小細胞型肺癌[7]。內(nèi)皮細胞可能通過胞外囊泡方式釋放血管生成素-2，從而調(diào)控腫瘤生長[8]。目前關(guān)于內(nèi)皮細胞的胞外囊泡對乳腺癌細胞的作用尚不完全清楚。本研究擬以MDA-MB-231和MCF-7細胞為研究對象，探討人臍靜脈內(nèi)皮細胞胞外囊泡(human umbilical vein endothelial cell-derived extracellular vesicles, HUVEC-EVs)對人乳腺癌細胞增殖和遷移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。H-DMEM、DMEM-F12、胎牛血清、胰酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT試劑(美國Amrgsco公司)；二甲基亞砜溶液(上海生工公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Matrigel膠(美國BD公司)；鏈霉素、青霉素、蛋白質(zhì)裂解液RIPA和BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天公司；兔抗人JAK2抗體、兔抗人p-STAT3抗體、兔抗人GAPDH抗體、鼠抗人STAT3抗體均為美國CST公司產(chǎn)品；兔抗人p-JAK2抗體(美國Abcam公司)；HRP標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗鼠IgG(上海愛必信公司)。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞。并用含10%胎牛血清、100 U/mL 青、鏈霉素的DMEM-F12，于37 ℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVEC，用于收集培養(yǎng)上清液及胞外囊泡。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231和MCF-7細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 胞外囊泡的提取

HUVEC生長至90%左右融合度時，用無血清培養(yǎng)基孵育24 h，收集上清液；4℃以2 000×g離心20 min，去除細胞和碎片；然后于4℃以100 000×g超速離心1 h；將沉淀重懸于PBS中，以100 000×g超離心1 h；胞外囊泡的濃度按照BCA蛋白定量試劑盒說明書操作進行定量。

1.4 MTT實驗檢測乳腺癌細胞增殖能力

MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞分別用含0、10、20或40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM處理24 h；收集細胞，以2×103個/孔細胞密度接種于96孔板，每組設5個復孔，并設置4個時間點(0、24、48和72 h)。分別按照設置時間點，在每孔中加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)4 h；每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，置于搖床上低速震蕩10 min，以確保結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀測定490 nm波長處各孔光密度值。

1.5 平板克隆實驗檢測乳腺癌細胞克隆能力

MDA-MB-231和MCF-7細胞分別用含有0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM處理24 h；收集細胞，計數(shù)，以500個/孔細胞密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)10 d；4%多聚甲醛固定細胞30 min；PBS洗2遍；結(jié)晶紫染色15 min；PBS洗2～3遍；拍照計數(shù)并統(tǒng)計分析。

1.6 Transwell遷移實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs分別處理MDA-MB-231和MCF-7細胞24 h；計數(shù)，以1×105/孔細胞重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基中；將細胞懸液全部滴加于Transwell小室中，在下室內(nèi)分別加入800 μL含10%胎牛血清的營養(yǎng)液，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)8 h；吸干上室內(nèi)液體，用棉簽除去未遷移細胞，將小室移入4%多聚甲醛中固定30 min；結(jié)晶紫染色30 min；在顯微鏡下隨機觀察3個視野，并進行計數(shù)和統(tǒng)計。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測乳腺癌細胞侵襲能力

將30 μL基質(zhì)膠與90 μL預冷PBS混合，添加至Transwell小室上室中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs處理MDA-MB-231和MCF-7細胞24 h；計數(shù)，以1×105/孔細胞重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基中；將細胞懸液全部滴加于Transwell小室中，在下室內(nèi)分別加入800 μL含10%胎牛血清的營養(yǎng)液，放置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)30 h，后續(xù)操作同“1.6”。

1.8 劃痕實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

MDA-MB-231和MCF-7細胞分別用含有0、10、20、40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM處理24 h；收集細胞，接種于6孔板，待細胞融合至80%左右，用200 μL移液槍頭在6孔板中劃3條直線，再用無血清培養(yǎng)液漂洗直到無漂浮的細胞為止，在顯微鏡下觀察。并于0 h、24 h時在多個部位拍照，拍取代表性圖像。最后計數(shù)0 h到24 h的劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.9 蛋白質(zhì)印跡實驗檢測JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達

MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞分別用含有0、10、20或40 μg/mL HUVEC-EVs的H-DMEM處理24 h；棄培養(yǎng)液，加入RIPA裂解液裂解細胞，全程冰上操作，提取總蛋白，并用BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白，80 V電泳30 min，然后將電壓調(diào)至100 V，繼續(xù)電泳1 h；以350 mA濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗人JAK2抗體、兔抗人p-JAK2抗體、兔抗人GAPDH抗體(內(nèi)參)、鼠抗人STAT3抗體，均1 ∶1 000稀釋，兔抗人p-STAT3抗體(1 ∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次15 min；HRP標記羊抗兔/羊抗鼠二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次15 min；ECL曝光顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)進行拍照。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HUVEC-EVs促進乳腺癌細胞增殖

MTT結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞中，與0 μg/mL HUVEC-EVs組相比，10和20 μg/mL HUVEC-EVs組48 h、72 h細胞增殖率顯著增高(P<0.05)，呈一定的濃度依賴性和時間依賴性，40 μg/mL HUVEC-EVs組48 h、72 h細胞增殖率明顯增高(P<0.05)，呈一定的時間依賴性，但明顯低于20 μg/mL HUVEC-EVs組(P<0.05)。對于MCF-7細胞而言，與0 μg/mL HUVEC-EVs組相比，20、40 μg/mL HUVEC-EVs組24 h細胞增殖率明顯增高(P<0.05)，呈一定的濃度依賴性。與0 μg/mL HUVEC-EVs相比，3種濃度處理組48 h時細胞增殖率均顯著升高(P<0.05)；72 h時細胞增殖率開始下降，但仍高于0 μg/mL HUVEC-EVs組。以上結(jié)果提示，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs處理乳腺癌細胞能顯著促進其增殖能力。見圖1。

a：P<0.01，與同濃度0 h HUVEC-EVs組比較；b：P<0.05，與同時間點0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；c：P<0.05，與同時間點10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；d：P<0.05，與同時間點20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖1 MTT實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理不同時間后乳腺癌細胞增殖能力

2.2 HUVEC-EVs增強乳腺癌細胞克隆形成能力

平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，HUVEC-EVs處理24 h后，與0 μg/mL 組相比，MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞20和40 μg/mL HUVEC-EVs組細胞克隆形成數(shù)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，且40 μg/mL組明顯高于20 μg/mL組(P<0.01)。見圖2。

2.3 HUVEC-EVs增強乳腺癌細胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞，與0 μg/mL 組相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs組細胞遷移數(shù)均明顯增多(P<0.05或P<0.01)，見圖3。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，MDA-MB-231和MCF-7細胞，與0 μg/mL 組相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs組細胞侵襲數(shù)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，20、40 μg/mL HUVEC-EVs組和10 μg/mL HUVEC-EVs組間均存在統(tǒng)計學差異，見圖4。劃痕實驗結(jié)果顯示，MDA-MB-231和MCF-7細胞，與0 μg/mL HUVEC-EVs對照組相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs處理后的劃痕愈合率明顯升高(P均<0.01)。見圖5。

a：P<0.05，b：P<0.01，與0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；e：P<0.05，f：P<0.01，與20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖2 平板克隆實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理后乳腺癌細胞克隆形成能力

a：P<0.05，b：P<0.01，與0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；c：P<0.01，與10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；d：P<0.05，e：P<0.01，與20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖3 Transwell遷移實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理后乳腺癌細胞遷移能力(×100)

a：P<0.01，與0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；d：P<0.01，與20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖4 Transwell侵襲實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理后乳腺癌細胞侵襲能力(×100)

a：P<0.01，與0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；b：P<0.01，與10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖5 劃痕實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理后乳腺癌細胞遷移能力(×40)

2.4 HUVEC-EVs促進乳腺癌細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞，與0 μg/mL HUVEC-EVs對照組相比，10、20和40 μg/mL HUVEC-EVs處理后p-JAK2和p-STAT3蛋白表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而總JAK2和STAT3蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖6。

a：P<0.05，b：P<0.01，與0 μg/mL HUVEC-EVs組比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與10 μg/mL HUVEC-EVs組比較；e：P<0.01，與20 μg/mL HUVEC-EVs組比較

圖6 蛋白質(zhì)印跡實驗檢測不同濃度HUVEC-EVs處理后乳腺癌細胞相關(guān)蛋白表達

3 討論

胞外囊泡在細胞間通訊交流中起重要作用，特別是在癌癥發(fā)生發(fā)展中[9]。內(nèi)皮細胞源胞外囊泡通過遞送內(nèi)容物，從而調(diào)控靶細胞的增殖、遷移、凋亡等功能[10]。研究表明內(nèi)皮細胞源胞外囊泡中miR 503可抑制CCND2和CCND3基因表達，從而抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[11]。但本研究MTT實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，經(jīng)HUVEC-EVs處理后乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞增殖能力明顯增強；在72 h，MDA-MB-231細胞增殖仍增高，但MCF-7細胞增殖數(shù)有所下降，推測該現(xiàn)象可能是因為在48 h時MCF-7細胞數(shù)已接近飽和，后無空間再生長而導致細胞活性逐漸下降；此外，兩種乳腺癌細胞系惡性程度等都有區(qū)別，導致結(jié)果不完全一致。Transwell實驗及劃痕實驗結(jié)果顯示，HUVEC-EVs處理后，兩種乳腺癌細胞遷移和侵襲能力也明顯增強。除了增殖、遷移、侵襲外，HUVEC-EVs是否還參與乳腺癌細胞的其他生物學行為，如相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路激活還有待進一步研究。

JAK2/STAT3途徑是STAT3信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵途徑[12]。研究顯示，在乳腺癌、非小細胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中，JAK、STAT呈異常表達和過度激活，尤其是STAT3處于持續(xù)活化狀態(tài)[13]。STAT3是一種多功能蛋白，通過調(diào)節(jié)cyclin D1、Bcl-2和Bcl-xL等蛋白表達，影響細胞周期、細胞增殖和凋亡等多種生物學過程，最終控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[14]。研究表明，在高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系中，siRNAs特異性沉默STAT3后，細胞遷移和侵襲能力下降[15]。研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過激活乳腺癌細胞JAK2/STAT3信號通路上調(diào)Bcl-2和cyclin D1表達，從而抑制細胞凋亡和促進腫瘤生長[16]。本研究結(jié)果顯示，HUVEC-EVs處理后，乳腺癌細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達升高，提示HUVEC-EVs介導乳腺癌細胞磷酸化過程。

綜上所述，HUVEC-EVs可能通過JAK2/STAT3通路的磷酸化來促進乳腺癌細胞增殖和遷移，該過程中涉及多個環(huán)節(jié)，是否還有其他通路參與有待進一步研究。