蔡茸， 張靜靜， 徐麗霞， 劉蘇婉， 劉勁靜， 龔愛(ài)華， 張苗苗， 杜鳳移

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

近年來(lái)，碳量子點(diǎn)因其優(yōu)異的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)以及許多潛在的應(yīng)用而受到人們的廣泛關(guān)注[1-3]。目前，由于其水分散性好、化學(xué)惰性強(qiáng)、光穩(wěn)定性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，碳量子點(diǎn)在生物工程領(lǐng)域掀起了研究熱潮。本課題組前期的研究證明，碳量子點(diǎn)在抗氧化功能[4]、CT成像功能[5]和載基因功能[6]等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛能。

光熱消融(photothermal ablation, PTA)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型腫瘤治療手段，具有精確、可控、高效和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。PTA主要利用具有高效光熱轉(zhuǎn)換效率的材料富集在腫瘤部位，并在外部光源的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[9-10]。盡管PTA在腫瘤治療中表現(xiàn)出一定的效果，但尚缺乏生物相容性好、光熱轉(zhuǎn)化性能高的光敏劑，所以在一定程度上阻礙了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。有研究報(bào)道稱，碳基納米材料具有較好的光熱轉(zhuǎn)換性能[11-12]。鑒于此，本文旨在探索制備新型高效光熱轉(zhuǎn)換效率的納米光敏劑鈰摻雜的碳量子點(diǎn)(cerium doped carbon quantum dots, Ce-doped CDs)，及其抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

草酸鈰(上海阿拉丁試劑公司)；甘氨酸(德國(guó)biofroxx公司)；胎牛血清和DMEM(美國(guó)Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；高分辨透射電子顯微鏡(日本東京喬爾有限公司)；熒光光譜儀(美國(guó)瓦里安公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀(南京麥高德生物科技有限公司)；808 nm激光器(北京鐳志威光電技術(shù)有限公司)；熱成像攝像機(jī)(東莞新泰儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)比奧泰克儀器公司)。

1.2 Ce-doped CDs的制備

稱取0.2 g草酸鈰溶解于24 mL去離子水(含4 mL濃鹽酸)中，在85 ℃下持續(xù)攪拌1 h，再加入0.8 g甘氨酸，攪拌0.5 h，形成透明液體。將溶液轉(zhuǎn)移到微波爐中高火加熱10 min以得到碳化的黑色塊狀物，倒入20 mL水溶解。黑色溶液以2 000 r/min離心10 min去除沉淀，將上清液透析、凍干，得到的黑色粉末即Ce-doped CDs。

1.3 Ce-doped CDs的形貌和光學(xué)表征

采用透射電子顯微鏡在200 kV加速電壓下觀察Ce-doped CDs的形貌特征，同時(shí)，利用熒光光譜儀檢測(cè)Ce-doped CDs的熒光信號(hào)。

1.4 Ce-doped CDs的光熱效能

將Ce-doped CDs配成不同濃度(40、80、120、160、200 μg/mL)水溶液，在功率密度為1.0 W/cm2的808 nm近紅外激光下照射各水溶液，同時(shí)，以去離子水作為對(duì)照組，另外，再用不同功率密度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 W/cm2)的808 nm近紅外激光照射200 μg/mL 的Ce-doped CDs水溶液，每隔30 s記錄溫度變化的數(shù)值。為了探究Ce-doped CDs的光熱再生性和穩(wěn)定性，將200 μg/mL 水溶液置于1.0 W/cm2的808 nm近紅外激光照射下進(jìn)行5次加熱-冷卻循環(huán)。

1.5 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法測(cè)定不同濃度的Ce-doped CDs對(duì)細(xì)胞活力的影響。將1.5×104個(gè)MEF細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系)和4T1細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞系)分別接種于96孔板中孵育24 h，加入不同濃度的Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育48 h，再加入CCK-8試劑，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處每孔的光密度。另外，為了檢測(cè)光照對(duì)加入不同濃度Ce-doped CDs的細(xì)胞活力的影響，將不同濃度Ce-doped CDs(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL)孵育的細(xì)胞置于808 nm激光下照射5 min，24 h后加入CCK-8試劑測(cè)定光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ce-doped CDs的形貌表征

高倍透射電子顯微鏡觀察結(jié)果(圖1A)顯示，制備的Ce-doped CDs形態(tài)均一、近似顆粒狀，在室溫下均勻分散于水中且無(wú)明顯沉淀。另外，更加高倍視野的透射電子顯微鏡圖像顯示Ce-doped CDs具有混合相結(jié)構(gòu)，即同時(shí)具有非晶格和晶格兩種結(jié)構(gòu)，如圖1B所示，線條圈出納米顆粒，箭頭所指區(qū)域能清楚地看到晶格結(jié)構(gòu)。同時(shí)，Image J軟件分析所制得的粒徑分布曲線符合高斯正態(tài)分布，如圖1C所示，該曲線顯示Ce-doped CDs的平均尺寸約為(2.59±0.37) nm，符合高斯正態(tài)分布曲線。

A、B：Ce-doped CDs的高倍透射電鏡圖；C：Ce-doped CDs的粒徑分布

圖1 Ce-doped CDs的透射電鏡圖和粒徑分布

2.2 Ce-doped CDs的光學(xué)性能

利用熒光光譜檢測(cè)Ce-doped CDs的熒光性能。Ce-doped CDs的光譜圖(圖2A)顯示熒光光譜的發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)有很密切的聯(lián)系，雖然隨著激發(fā)波長(zhǎng)以20 nm為間隔從320 nm增加到440 nm，發(fā)射光譜從417 nm移動(dòng)到505 nm，但其熒光強(qiáng)度在360 nm激發(fā)波長(zhǎng)下開(kāi)始增加，達(dá)到峰值后再逐漸遞減。歸一化發(fā)射光譜之后，如圖2B可以看出，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加，Ce-doped CDs的發(fā)射光譜發(fā)生了約40 nm的紅移。同時(shí)，在360 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察到440 nm處的最大發(fā)射(圖2C)。

2.3 Ce-doped CDs的光熱性能

固定近紅外光功率為1.0 W/cm2，研究不同濃度Ce-doped CDs溶液的溫度變化。如圖3顯示，溶液溫度變化呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。值得注意的是，Ce-doped CDs在200 μg/mL濃度下經(jīng)過(guò)光照6 min即可達(dá)到55.1 ℃，通過(guò)調(diào)節(jié)Ce-doped CDs的溶質(zhì)含量，使溶液的溫度精確控制在20 ℃～55 ℃，而對(duì)照組在同等照射條件下溫度無(wú)明顯變化。

A：不同激發(fā)波長(zhǎng)下 Ce-doped CDs的熒光光譜圖；B：Ce-doped CDs的歸一化熒光光譜圖；C：最大激發(fā)波長(zhǎng)下Ce-doped CDs的最大發(fā)射光譜圖2 表征Ce-doped CDs的光學(xué)性能

A：不同濃度Ce-doped CDs在近紅外光(808 nm)激發(fā)下的光熱曲線圖；B：相應(yīng)的近紅外熱成像圖圖3 不同Ce-doped CDs濃度下的光熱成像圖

隨后，固定Ce-doped CDs濃度為200 μg/mL，研究不同功率密度的近紅外光對(duì)溫度變化的影響。如圖4所示，Ce-doped CDs的溫度升高與功率密度呈正相關(guān)。

A： 不同功率密度下Ce-doped CDs在近紅外光(808 nm)激發(fā)下的光熱曲線圖；B：相應(yīng)的近紅外熱成像圖圖4 不同功率密度下的光熱成像圖

另外，利用激光開(kāi)-關(guān)5個(gè)循環(huán)周期對(duì)Ce-doped CDs的光熱重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，所獲得的溫度變化曲線圖在5個(gè)周期內(nèi)相互匹配良好(圖5)。以上結(jié)果說(shuō)明制備的Ce-doped CDs具有非?？煽康墓鉄徂D(zhuǎn)換穩(wěn)定性，且光熱轉(zhuǎn)換效率呈現(xiàn)濃度和功率密度依賴性。

圖5 Ce-doped CDs水溶液在5個(gè)激光開(kāi)關(guān)周期內(nèi)的溫度變化曲線圖

2.4 Ce-doped CDs的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)

如圖6A所示，MEF和4T1細(xì)胞在不同濃度的Ce-doped CDs作用下依舊顯示很好的生物相容性以及低毒性，甚至在高濃度1 200 μg/mL下對(duì)細(xì)胞活力也無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，不同濃度Ce-doped CDs孵育過(guò)的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

測(cè)量近紅外激光照射經(jīng)Ce-doped CDs孵育過(guò)的細(xì)胞活力結(jié)果顯示，隨著Ce-doped CDs濃度的增加，在相同近紅外激光(808 nm，1.0 W/cm2)照射下，細(xì)胞活力逐漸遞減。如圖6B、6C所示，無(wú)論是正常細(xì)胞MEF還是腫瘤細(xì)胞4T1，都有相同的變化趨勢(shì)，值得注意的是，在其他條件均一致的情況下，4T1細(xì)胞活力下降趨勢(shì)更加明顯，在1 200 μg/mL濃度的Ce-doped CDs處理下，MEF細(xì)胞依舊有79%的存活率，而4T1細(xì)胞僅剩7%。這說(shuō)明我們制備的Ce-doped CDs具有很好的光熱轉(zhuǎn)換性能，同時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)溫度變化更加敏感，所以其光熱殺傷效果更加顯著。

A：Ce-doped CDs的生物相容性；B、C：808 nm(1.0 W/cm2，5 min)近紅外激光下Ce-doped CDs對(duì)MEF細(xì)胞和4T1細(xì)胞的殺傷性能

圖6 Ce-doped CDs的生物相容性和體外細(xì)胞近紅外殺傷性能

3 討論

本研究以草酸鈰和甘氨酸為前驅(qū)物，通過(guò)微波水熱碳化法合成Ce-doped CDs。其形態(tài)均一、粒徑微小、生物相容性好，具有混合物相結(jié)構(gòu)。Ce-doped CDs表現(xiàn)出與傳統(tǒng)碳量子點(diǎn)類似的熒光性能，表面存在空洞結(jié)構(gòu)，這使得其通過(guò)空洞進(jìn)行能量?jī)?chǔ)存而導(dǎo)致光致發(fā)光成為可能[13]。值得注意的是，Ce-doped CDs還具備優(yōu)越的光熱轉(zhuǎn)換效率與可重復(fù)利用性。用相同功率密度(1.0 W/cm2)照射不同濃度的Ce-doped CDs水溶液，甚至最低濃度為40 μg/mL時(shí)，其光熱轉(zhuǎn)換效果也很顯著；用不同功率密度的近紅外光照射相同濃度的Ce-doped CDs水溶液，甚至是低功率密度(0.2 W/cm2)，與純水接收最高功率密度(1.0 W/cm2)近紅外光照射相比，其光熱轉(zhuǎn)換能力依舊很高。這不僅證明Ce-doped CDs的光熱轉(zhuǎn)換效率與濃度和功率密度皆呈正相關(guān)，還說(shuō)明其光熱轉(zhuǎn)換能力突出，只需極低濃度或功率密度即可發(fā)揮作用。

更重要的是，Ce-doped CDs具有高效的近紅外光熱轉(zhuǎn)換性能，可在808 nm波長(zhǎng)的近紅外光照射下將溶液迅速升溫至55.1 ℃，從而顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。關(guān)閉光熱開(kāi)關(guān)后可迅速恢復(fù)到室溫，而再次連續(xù)加熱4次，在同樣的時(shí)間段內(nèi)依舊能夠達(dá)到之前的溫度，這說(shuō)明反復(fù)間斷近紅外照射不會(huì)影響Ce-doped CDs的光熱轉(zhuǎn)換效果，具有可重復(fù)利用性。而正常細(xì)胞卻表現(xiàn)出較好的熱耐受性，可顯著降低光熱消融對(duì)正常組織的損傷，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。因此，本研究制備的Ce-doped CDs在乳腺癌的光熱治療領(lǐng)域表現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛能，將豐富和改變目前臨床上抗腫瘤的治療模式和治療思路。