高乾乾， 張娜娜， 王昊冉， 陳怡靜， 劉婷婷， 沈?？?/p>

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

多藥耐藥是目前腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥是改善腫瘤化療效果的關(guān)鍵性問題[1]。納米給藥系統(tǒng)的出現(xiàn)為抗腫瘤多藥耐藥帶來了機(jī)遇。利用納米給藥系統(tǒng)將光熱治療、光動力治療、化學(xué)治療相聯(lián)合，可以顯著提高腫瘤的治療效果，已成為抗腫瘤多藥耐藥的新型且有效的手段[2-5]。目前，金納米粒、硫化銅納米粒、石墨烯納米片等納米材料都具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力，在腫瘤的光熱治療方面展示了良好的應(yīng)用潛力[6-8]。但是，這些材料的生物安全性尚未明確，限制了其臨床應(yīng)用。因而，開發(fā)具有良好生物相容性的納米材料，并能夠?qū)崿F(xiàn)化療和光療的聯(lián)合治療策略具有重要的意義。

本研究擬采用4種食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用的生物材料：D-α-生育酚琥珀酸酯(D-α-tocopherol succinate，TOS)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)、多柔比星(doxorubicin，DOX)，構(gòu)建一種負(fù)載DOX和ICG的人血清白蛋白-生育酚納米粒(DOX-loaded HSA-ICG-TOS nanoparticles，簡稱DOX-HIT-NPs)。其中，DOX為廣譜抗癌藥，具有良好的化療效果；ICG在近紅外光照下具有光熱治療和光動力治療的能力[9]；TOS是維生素E家族中最有效的抗癌藥物，可以引起乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種癌細(xì)胞系的凋亡[10]，并可以增加DOX對乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/ADR)的毒性[11]。因此，DOX-HIT-NPs有望實(shí)現(xiàn)化學(xué)治療、光熱治療與光動力治療的聯(lián)合應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HSA(Sigma公司)；TOS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自阿拉丁試劑有限公司；ICG(日本東京化學(xué)工業(yè)有限公司)；DOX(北京華奉聯(lián)博科技有限公司)；Live/Dead細(xì)胞染色試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher公司)；DCFH-DA探針(ROS測試盒)購自南京建成生物研究所；CCK8試劑盒(日本Dojindo公司)；紅外熱成像儀(德國儀器國際貿(mào)易有限公司)；808 nm光纖耦合激光器(西安赫胥爾鐳得激光科技有限公司)。

1.2 DOX-HIT-NPs的制備

首先制備HIT-NPs：稱取5 mg HSA溶于10 mL去離子水中，30 mg TOS溶于1 mL乙醇中， 10 mg ICG 溶于1 mL的DMSO中。向TOS溶液中加入適量的EDC和NHS，反應(yīng)15 min。將10 mL HSA水溶液置于50 mL的離心管中，攪拌條件下，將100 μL TOS(EDC/NHS)溶液逐滴加入到HSA水溶液中，最后將50 μL的ICG溶液逐滴加入到上述混合溶液中，避光攪拌4 h，14 800 r/min離心20 min收集納米粒，去離子水離心洗滌3次，將獲得的HSA-ICG-TOS nanoparticles(HIT-NPs)分散到10 mL去離子水中，備用。

然后制備DOX-HIT-NPs：取1 mL HIT-NPs溶液置于離心管中，將1 mL DOX溶液(0.062 5 mg/mL)逐滴加入，避光攪拌3 h，離心收集納米粒，去離子水超聲分散、洗滌、離心，將獲得的搭載DOX的HIT-NPs(DOX-HIT-NPs)分散到1 mL去離子水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DOX-HIT-NPs的表征

取超聲分散后的DOX-HIT-NPs納米粒溶液，加10 μL溶液于銅網(wǎng)上，自然晾干后，用透射電鏡進(jìn)行觀察；采用粒度電位分析儀檢測DOX-HIT-NPs的粒徑；準(zhǔn)備ICG、DOX和DOX-HIT-NPs水溶液，用紫外分光光度計分別進(jìn)行掃描，波長范圍200～900 nm。

1.4 DOX-HIT-NPs的載藥量和分散性

按照將DOX負(fù)載于HIT-NPs的方法，離心后收集上清液，檢測上清液在480 nm處的光密度值。通過參考標(biāo)準(zhǔn)曲線將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為DOX濃度，計算DOX-HIT-NPs的載藥量和包封率。將獲得的DOX-HIT-NPs納米粒分散到水、PBS、DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基中考察其分散性。計算公式如下：負(fù)載DOX的量(μg)= 投入DOX的總量-上清液中DOX的量；載藥量 =(負(fù)載DOX的量/DOX-HIT-NPs的量)×100%；包封率 =(負(fù)載DOX的量/投入DOX的總量)×100%。

1.5 DOX-HIT-NPs的光熱轉(zhuǎn)換能力

配制不同濃度的DOX-HIT-NPs溶液，用近紅外激光(808 nm，2 W/cm2)照射5 min，每隔30 s用浸入溶液中的熱電偶測量納米顆粒溶液的溫度，并用數(shù)顯溫度計進(jìn)行記錄；近紅外激光照射3 min后，用紅外熱成像儀拍攝照片。

1.6 DOX-HIT-NPs的細(xì)胞攝取

將MCF-7/ADR細(xì)胞按1×105個/孔接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁后，用含有游離DOX或DOX-HIT-NPs(DOX濃度為10 μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基處理細(xì)胞。隨后，用PBS小心洗滌細(xì)胞3次，并用4%(w/v)多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用PBS小心洗滌細(xì)胞3次；然后用DAPI對細(xì)胞核染色5～10 min，用PBS小心洗滌細(xì)胞3次，封片準(zhǔn)備觀察，最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察DOX的細(xì)胞攝取。

1.7 DOX-HIT-NPs的細(xì)胞毒性

首先，通過測定近紅外光照后活性氧的水平評價DOX-HIT-NPs光動力治療的可能性。將2×104/孔MCF-7/ADR細(xì)胞接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞分別暴露于完全培養(yǎng)基(對照組)、對照+光照、游離DOX、DOX-HIT-NPs、DOX-HIT-NPs+光照(DOX濃度為10 μg/mL)。激光照射采用808 nm，2 W/cm2，5 min。培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，然后加入用PBS稀釋1 000倍的DCFH-DA探針，反應(yīng)20 min左右，用PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察。

然后，考察DOX-HIT-NPs的體外化療-熱療-光動力治療的聯(lián)合治療效果。將MCF-7/ADR細(xì)胞分別接種在96孔板中(5×103個/孔)，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，按照下列組別進(jìn)行處理：完全培養(yǎng)基(對照組)、對照+光照組、游離DOX組、DOX-HIT-NPs組、DOX-HIT-NPs+光照組(DOX濃度為10 μg/mL)，處理后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)22 h，CCK8法測定細(xì)胞活力；另外，用24孔板同法培養(yǎng)與處理細(xì)胞，Live/Dead染色試劑盒進(jìn)行定性分析，熒光顯微鏡觀察染色后的活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DOX-HIT-NPs的制備和表征

透射電鏡觀察DOX-HIT-NPs的形態(tài)(圖1A)顯示，DOX-HIT-NPs是近似球形的納米粒。DOX-HIT-NPs的粒徑分布圖顯示(圖1B)，DOX-HIT-NPs呈正態(tài)分布，平均粒徑為278.8 nm，粒徑結(jié)果比透射電鏡顯示的顆粒稍大，可能是由于DOX-HIT-NPs表面的蛋白水化層導(dǎo)致的。

HIT-NPs用去離子水離心、洗滌3次后，將獲得的納米顆粒重新分散到水中，呈現(xiàn)明顯的綠色(圖1C)，因?yàn)門OS和HSA均為無色，只有ICG為綠色，直觀地表明HIT-NPs中存在ICG。進(jìn)一步地，紫外分光光譜顯示DOX-HIT-NPs與游離的ICG在780 nm附近都有一個吸收峰，是ICG的特征吸收峰(圖1D)。此結(jié)果證明ICG成功地結(jié)合到納米顆粒中。與游離ICG相比，HIT-NPs的吸收峰出現(xiàn)了輕微的紅移，這可能是由于ICG與白蛋白復(fù)合后分子構(gòu)象變化所致。同樣的DOX-HIT-NPs在近480 nm處具有DOX的特征吸收峰，與游離DOX的特征峰相一致，該結(jié)果證明了DOX成功加載到DOX-HIT-NPs中。

A：DOX-HIT-NPs的透射電鏡照片；B：DOX-HIT-NPs的粒徑分布；C：HIT-NPs分散在水中；D：ICG、DOX和DOX-HIT-NPs的紫外可見吸收光譜

圖1 DOX-HIT-NPs的表征

2.2 DOX-HIT-NPs的載藥量和分散性

根據(jù)DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得DOX-HIT-NPs的載藥量為16.0%，包封率為90.1%，表明投入的DOX幾乎全部能搭載到HIT-NPs上，說明納米粒具有良好的載藥能力。如圖2結(jié)果所示，獲得的DOX-HIT-NPs可以很容易地分散到水溶液、PBS溶液、DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基中，其良好的分散性有利于納米粒在這些體系中的穩(wěn)定存在，在開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)時不會造成聚集而沉淀。

圖2 DOX-HIT-NPs在水、PBS、DMEM、RPMI 1640中分散性

2.3 DOX-HIT-NPs的光熱轉(zhuǎn)換能力

通過近紅外激光(808 nm，2 W/cm2)照射來考察DOX-HIT-NPs的光熱轉(zhuǎn)換能力。如圖3A所示，在相同的近紅外激光照射強(qiáng)度下，H2O溶液上升的溫度可忽略不計，而DOX-HIT-NPs能夠在近紅外激光照射下誘導(dǎo)其分散液的快速升溫。在60 s內(nèi)，濃度為0.21 mg/mL DOX-HIT-NPs分散液的溫度從室溫25.7 ℃升高到45.1 ℃，隨著光照時間的延長，最高溫度可達(dá)到47.9 ℃。當(dāng)DOX-HIT-NPs濃度為0.35 mg/mL，分散液的最高溫度可達(dá)到55.5 ℃。紅外熱成像儀對近紅外光照射3 min后的納米顆粒懸液進(jìn)行拍照(圖3B)所示，紅外熱成像圖像與溫度曲線相吻合，相同的光照條件下，納米粒的濃度越高，溫度越高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOX-HIT-NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力。

A：DOX-HIT-NPs的光熱升溫曲線；B：DOX-HIT-NPs的熱成像圖片圖3 DOX-HIT-NPs的光熱轉(zhuǎn)換能力

2.4 DOX-HIT-NPs的細(xì)胞攝取

運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡考察MCF-7/ADR細(xì)胞對DOX-HIT-NPs的攝取，結(jié)果見圖4，紅色代表DOX的熒光，藍(lán)色代表DAPI的熒光(DAPI主要用于標(biāo)記細(xì)胞核)。圖中游離DOX在MCF-7/ADR細(xì)胞中含量較少，細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒有(紅色和藍(lán)色熒光的無重疊)，表現(xiàn)出DOX耐藥細(xì)胞株的典型特點(diǎn)。而DOX-HIT-NPs的細(xì)胞攝取明顯高于游離DOX，并且細(xì)胞核內(nèi)的DOX含量亦增高，說明DOX-HIT-NPs可以促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞對DOX的攝取，具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

2.5 DOX-HIT-NPs體外光動力治療能力評價

如圖5結(jié)果所示，在對照組、對照+光照組和游離DOX組都沒有檢測到綠色熒光，說明單純的光照和DOX不會產(chǎn)生活性氧；MCF-7/ADR細(xì)胞在DOX-HIT-NPs處理后可以產(chǎn)生綠色的熒光，說明DOX-HIT-NPs可以產(chǎn)生活性氧，這主要是因?yàn)镈OX-HIT-NPs中含有TOS，根據(jù)文獻(xiàn)報道，TOS可能會影響線粒體復(fù)合體Ⅱ的泛醌結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)活性氧的快速生成。MCF-7/ADR細(xì)胞在DOX-HIT-NPs+光照條件下產(chǎn)生的綠色熒光更強(qiáng)，說明DOX-HIT-NPs在光照后活性氧升高，提示DOX-HIT-NPs在近紅外光照條件下具有光動力治療的能力。

圖4 DOX-HIT-NPs的細(xì)胞攝取(×600)

圖5 不同因素處理后MCF-7/ADR細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生情況(×200)

2.6 DOX-HIT-NPs的體外化療-熱療-光動力治療的聯(lián)合治療效果評價

如圖6所示，用單純近紅外激光照射MCF-7/ADR細(xì)胞，細(xì)胞存活率為98.7%，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，說明單純光照對MCF-7/ADR細(xì)胞無影響。與游離DOX組的單純化療相比，用DOX-HIT-NPs治療后，MCF-7/ADR細(xì)胞的存活率明顯降低，與游離DOX組和DOX-HIT-NPs組相比，用DOX-HIT-NPs加光照治療后，MCF-7/ADR細(xì)胞的存活率顯著降低，表明近紅外光照產(chǎn)生的光熱治療和光動力治療顯著殺傷了MCF-7/ADR細(xì)胞，顯示出協(xié)同治療的效果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DOX-HIT-NPs對MCF-7/ADR細(xì)胞的聯(lián)合治療效果，我們通過Live/Dead染色定性地觀察了不同組別處理后的MCF-7/ADR細(xì)胞。結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，當(dāng)激光照射后基本上都是綠色信號，說明單純的激光照射對細(xì)胞沒什么影響；當(dāng)用游離DOX培養(yǎng)后，紅色的死細(xì)胞數(shù)量較少，說明MCF-7/ADR細(xì)胞對DOX具有一定的耐藥性；當(dāng)用DOX-HIT-NPs處理后，與游離DOX組相比，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，紅色信號的死細(xì)胞增多，說明DOX-HIT-NPs可以有效地殺傷MCF-7/ADR細(xì)胞；當(dāng)用DOX-HIT-NPs加光照處理后，死細(xì)胞數(shù)量明顯增多，綠色信號的活細(xì)胞明顯減少，說明在激光照射下DOX-HIT-NPs具有明顯的聯(lián)合治療效果。這些結(jié)果表明DOX-HIT-NPs可以聯(lián)合化療-熱療-光動力治療有效地殺傷耐藥的癌細(xì)胞。

*：P<0.05，與DOX組比較；#：P<0.05，與DOX-HIT-NPs組比較圖6 不同處理組對MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性

圖7 不同處理組MCF-7/ADR細(xì)胞的Live/Dead染色圖片(×200)

3 討論

多藥耐藥是腫瘤治療的瓶頸，單一的化療無法滿足當(dāng)前腫瘤治療的需要。光熱治療法是將光熱轉(zhuǎn)換材料注射入體內(nèi)，靶向聚集在腫瘤部位，在近紅外光的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能來殺死癌細(xì)胞，是一種無創(chuàng)/微創(chuàng)、恢復(fù)時間短、無耐藥性的治療方法。將傳統(tǒng)化療與光熱治療聯(lián)合可以明顯提高治療效果[3-5]，克服腫瘤的多藥耐藥。光熱治療的關(guān)鍵是光敏劑的選擇，無機(jī)納米材料具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能，并且可以作為化療藥物的載體，實(shí)現(xiàn)化療與光熱治療的結(jié)合，但是在體內(nèi)的安全性還有待評估[6-8]。本研究以生物相容性優(yōu)良的HSA、TOS、ICG為原料通過自組裝方式成功制備了HIT-NPs，并負(fù)載DOX得到DOX-HIT-NPs。將TOS和ICG逐滴添加到HSA水溶液中，ICG可以吸附到HSA的疏水域上[12]，而TOS一方面通過疏水作用力與HSA結(jié)合[13]，另一方面通過TOS的羧基與HSA的氨基反應(yīng)相互連接。由于TOS的疏水性，在水中會發(fā)生聚集而起到“粘合劑”的作用，將與之結(jié)合的HSA、與HSA結(jié)合的ICG自組裝到一起，在水溶液中形成HIT-NPs[13]。由于DOX和TOS之間可以形成離子配對[14]，可以將DOX負(fù)載到HIT-NPs上，形成DOX-HIT-NPs。DOX-HIT-NPs具有良好的分散性。光熱轉(zhuǎn)換能力結(jié)果表明，DOX-HIT-NPs的光熱轉(zhuǎn)換具有濃度依賴性，即DOX-HIT-NPs濃度越高，光熱效應(yīng)越明顯，提示可以通過控制DOX-HIT-NPs濃度來調(diào)節(jié)溫度，在不損傷正常細(xì)胞的情況下有效殺傷腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，TOS本身也可以促進(jìn)多種不同類型的腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死[10]。此外，TOS可以增加DOX對MCF-7/ADR細(xì)胞的毒性作用[11]，也可以誘導(dǎo)活性氧的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死[15-16]。我們的研究結(jié)果也證明，包含TOS的DOX-HIT-NPs可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，有效抑制MCF-7/ADR的生長。而DOX-HIT-NPs在光照條件下，可以明顯增加活性氧的產(chǎn)生，說明DOX-HIT-NPs不僅可以通過光熱作用殺死MCF-7/ADR細(xì)胞，還具有光動力治療的能力，可以利用產(chǎn)生活性氧的方式來殺死MCF-7/ADR細(xì)胞。另外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明DOX-HIT-NPs能夠增加MCF-7/ADR對DOX的攝取，對逆轉(zhuǎn)耐藥起到積極的作用；與游離DOX組和DOX-HIT-NPs組相比，用DOX-HIT-NPs加光照治療后，顯著抑制了MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖，說明DOX-HIT-NPs可以通過聯(lián)合化學(xué)治療、光熱治療和光動力治療來殺傷MCF-7/ADR細(xì)胞，達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。

綜上所述，DOX-HIT-NPs可以將TOS抗腫瘤作用、化學(xué)治療、光熱治療和光動力治療等多種作用有機(jī)整合在一起，對耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的殺傷效果，加上DOX-HIT-NPs使用的原料已為FDA批準(zhǔn)使用，具有優(yōu)良的生物相容性，因而，DOX-HIT-NPs有望為多藥耐藥腫瘤的臨床治療提供新的策略。