張良龍，安宏偉，趙立智，董 倩，高桂艷

1.滄州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 滄州 061000；

2.德州市陵城區(qū)中醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 德州 253500

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，患者的中位生存期僅為15～19個(gè)月［1-2］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）屬第二代烷化劑類抗腫瘤藥物，不經(jīng)過肝臟代謝、易于通過血腦屏障進(jìn)入腦脊液，能引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡，療效確切［3］。但TMZ單獨(dú)使用對惡性腦膠質(zhì)瘤的有效率仍不足50%，這是臨床治療所面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。LINC00152是異常表達(dá)于肝癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）之一，參與細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為［4-6］。最新研究顯示，LINC00152與腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后相關(guān)，下調(diào)LINC00152基因表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長［7］。還有研究顯示，上調(diào)LINC00152可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲［8］，提示LINC00152參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioblastoma stem cell，GSC）是存在于腦膠質(zhì)瘤中的一類細(xì)胞，具有自我更新迅速、無限增殖及多向分化潛能［9］。并且GSC與神經(jīng)干細(xì)胞類似，在腦膠質(zhì)瘤耐藥和復(fù)發(fā)中起到關(guān)鍵性作用［10］，但LINC00152與TMZ誘導(dǎo)的GSC周期阻滯的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究以神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，提取成球生長的GSC作為研究對象，以重組LINC00152基因慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GSC，獲得過表達(dá)LINC00152的GSC，并以嘌呤霉素篩選過表達(dá)LINC00152的細(xì)胞株，觀察LINC00152在TMZ誘導(dǎo)GSC周期阻滯中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；TMZ（貨號(hào)34219）購自美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、MEM全培養(yǎng)基、無血清干細(xì)胞MEM培養(yǎng)基、PBS、重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自美國Gibco公司；CD133抗體（貨號(hào)64326S）和Oct-4抗體（貨號(hào)2750S）購自美國CST公司；GAPDH抗體（貨號(hào)AP0063）、抗兔IgG-HRP二抗（貨號(hào)BS13278）、抗小鼠IgG-HRP二抗（貨號(hào)BS12478）購自南京巴傲得生物科技有限公司；總蛋白提取試劑盒和細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司；LINC00152慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、GSC提取

U251細(xì)胞以含15%FBS及1%青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。將U251細(xì)胞轉(zhuǎn)至無血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（含20 pg/L bFGF和20 pg/L EGF）中并加入B27補(bǔ)充劑培養(yǎng)并分離GSC。

1.3 免疫熒光鑒定GSC標(biāo)志蛋白表達(dá)

GSC在4%多聚甲醛中固定30 min后，室溫下用Triton X-100透核膜10 min。用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS封閉2 h，于4 ℃下溫育一抗CD133（1∶400）和Oct-4（1∶500）過夜，同時(shí)以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核。室溫溫育熒光二抗2 h，PBS洗片后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 構(gòu)建LINC00152過表達(dá)細(xì)胞株

以重組LINC00152基因慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GSC細(xì)胞構(gòu)建LINC00152過表達(dá)細(xì)胞株，設(shè)立過表達(dá)（LV-LINC00152）組和空載對照（LV）組，同時(shí)以正常GSC作為空白對照組。將U251細(xì)胞以每孔3×106個(gè)接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前配制病毒稀釋液，各配備兩管1 mL含10 μg/mL聚凝胺的MEM全培養(yǎng)基，分別加入100 μL重組LINC00152基因慢病毒原液和空載病毒原液，輕輕混勻。LVLINC00152組加入重組LINC00152基因慢病毒稀釋液，LV組加入空載病毒稀釋液，空白對照組細(xì)胞加入等量培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下過夜培養(yǎng)，12 h時(shí)更換為MEM全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期傳代，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定過表達(dá)LINC00152的細(xì)胞株。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測LINC00152表達(dá)水平

收集LV-LINC00152組、LV組和空白對照組細(xì)胞，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，用酶標(biāo)儀對各組細(xì)胞總RNA濃度進(jìn)行定量，各取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，稀釋cDNA至500 μL，充分混勻備用。各引物按正向引物與反向引物1∶1稀釋，利用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ在ABI 7300型RTFQ-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃10 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。2-△△Ct法計(jì)算LINC00152的相對表達(dá)水平。

1.6 TMZ處理

取空白對照組、LV組及LV-LINC00152組細(xì)胞，TMZ（200 μg·mL-1）處理LV組及LVLINC00152組細(xì)胞48 h，設(shè)立TMZ+LV組和TMZ+LV-LINC00152組?？瞻讓φ战M和LV組以等量TMZ溶劑處理48 h。

1.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測細(xì)胞活力

取所需空白對照組、LV組及LV-LINC00152組細(xì)胞，鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為6×103個(gè)，培養(yǎng)過夜后以TMZ處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立調(diào)零孔和對照孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱溫育3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（D）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將處理好的各組細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化。收集細(xì)胞于離心管中，1 200 rpm離心5 min，PBS洗2次后用70%乙醇在4 ℃環(huán)境中固定30 min，固定結(jié)束后1 200 rpm離心5 min，PBS洗2次，1 200 rpm離心5 min，加入300 μL PI/RNase染色液，室溫避光溫育60 min，將溫育好的細(xì)胞懸液加入樣品管中，用流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)光處檢測。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

藥物處理各組細(xì)胞48 h后，取出細(xì)胞并以蛋白刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，收集細(xì)胞懸液并1 200 rpm離心5 min，棄去上清液，PBS清洗1遍，1 200 rpm離心5 min，棄去上清液，將管內(nèi)液體吸凈，各組細(xì)胞加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解液裂解10 min，4 ℃下12 000 rpm離心20 min，吸取上清液置于冰上備用，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行定量，制備樣品。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白（各樣品上樣量為30 μg），轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜4 h，洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入CD133（1∶2 000）、Oct-4（1∶1 000）或GAPDH抗體（1∶1 000）4 ℃溫育過夜。第2天，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的二抗（1∶5 000），室溫溫育1 h，以ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀進(jìn)行成像并檢測灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較方法用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙尾）。

2 結(jié)果

2.1 GSC的分離鑒定

U251細(xì)胞在含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基中以單層細(xì)胞貼壁生長。生長24 h后用干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行分離培養(yǎng)，細(xì)胞以球形懸浮狀態(tài)生長。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)GSC表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Oct-4，表明GSC分離培養(yǎng)成功（圖1）。

圖1 GSC中CD133和Oct-4蛋白表達(dá)變化Fig.1 Changes in CD133 and Oct-4 protein expressions in GSC

2.2 各組GSC中LINC00152表達(dá)水平

各組細(xì)胞生長至對數(shù)期后以RTFQ-PCR檢測LINC00152水平，結(jié)果顯示，空白對照組、LV組和LV-LINC00152組GSC中LINC00152 RNA相對表達(dá)水平分別為0.32±0.02、0.33±0.03和1.56±0.12，組間總體比較存在差異（F=519.3，P＜0.000 1），與LV組相比，LV-LINC00152組LINC00152 RNA相對表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.000 1，圖2）。

圖2 各組LINC00152表達(dá)水平Fig.2 Expression level of LINC00152 in each group

2.3 LINC00152抵抗TMZ誘導(dǎo)的GSC細(xì)胞活力降低

TMZ處理48h后，CCK-8結(jié)果 顯示，空白對照組、LV 組、TMZ+LV 組和TMZ+LV-LINC00152組GSC細(xì)胞活力分別為100.0%、（98.2±9.6）%、（46.2±4.5）%和（77.3±6.8）%，組間總體比較存在差異（F=62.76，P＜0.000 1），空白對照組和LV組無明顯差異；與LV組相比，TMZ+LV組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.000 1）；而與TMZ+LV組相比，TMZ+LV-LINC00152組細(xì)胞活力明顯升高（P=0.000 1，圖3）。

圖3 各組細(xì)胞活力變化Fig.3 Changes in cell viability of each group

2.4 LINC00152抵抗TMZ誘導(dǎo)的GSC周期改變

TMZ處理48 h后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，空白對照組、LV組、TMZ+LV組和TMZ+LV-LINC00152組S期GSC細(xì)胞比例分別為（9.88±2.26）%、（10.21±3.16）%、（37.28±5.12）%和（17.75±4.06）%，各組間總體比較差異明顯（F=34.33，P＜0.000 1），空白對照組和LV組相比無明顯差異；與LV組相比，TMZ+LV組S期細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.0001）；而與TMZ+LV組相比，TMZ+LV-LINC00152組S期細(xì)胞比例明顯降低（P=0.000 2，圖4）。

圖4 各組細(xì)胞周期變化Fig.4 Cell cycle changes in each group

2.5 LINC00152逆轉(zhuǎn)TMZ誘導(dǎo)的GSC中S期相關(guān)蛋白水平

TMZ處理48 h后，Western blot檢測各組P53、Cyclin A、CDC25A和CDK2蛋白水平變化，結(jié)果顯示，空白對照組、LV組、TMZ+LV組和TMZ+LV-LINC00152組組間P53（F=65.23，P＜0.000 1）、CyclinA（F=41.85，P=0.000 1）、CDC25A（F=34.38，P＜0.000 1）、CDK2（F=52.22，P＜0.000 1）蛋白水平總體差異明顯?？瞻讓φ战M和LV組相比無明顯差異；與LV組相比，TMZ+LV組Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.000 1），P53蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.000 1）；而與TMZ+LV組相比，TMZ+LV-LINC00152組Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.000 1），P53蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.000 1，圖5）。

圖5 各組細(xì)胞S期相關(guān)蛋白表達(dá)變化Fig.5 Changes of S-phase related protein expression in each group

3 討 論

GSC是存在于腦膠質(zhì)瘤中的一類自我更新迅速、無限增殖及具有多向分化潛能的細(xì)胞［9］。研究［10］顯示，GSC與神經(jīng)干細(xì)胞類似，在腦膠質(zhì)瘤耐藥和復(fù)發(fā)中起到關(guān)鍵性作用。文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道，lncRNA LINC00152異常表達(dá)于膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中。最新研究［7］顯示，LINC00152與腦膠質(zhì)瘤臨床不良預(yù)后相關(guān)，下調(diào)LINC00152基因表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長，提示LINC00152在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促癌效應(yīng)。本研究以神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，分離成球生長的細(xì)胞球。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞CD133和Oct-4蛋白水平明顯上調(diào)。CD133和Oct-4已被公認(rèn)為干細(xì)胞標(biāo)志物用于多種腫瘤干細(xì)胞研究［13］。有研究顯示，CD133或Oct-4陽性表達(dá)是腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性的標(biāo)志之一，提示本研究［14-15］成功提取了GSC細(xì)胞球。

TMZ作為腦膠質(zhì)瘤的一線化療藥物，能引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡，具有確切的療效［3］，但TMZ治療一段時(shí)候后往往會(huì)失去療效。為觀察LINC00152在TMZ誘導(dǎo)GSC周期阻滯中的作用，本研究以慢病毒轉(zhuǎn)染法外源性上調(diào)LINC00152表達(dá)水平并以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的GSC細(xì)胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMZ能誘導(dǎo)GSC細(xì)胞活力降低和S期阻滯，而LINC00152過表達(dá)能抑制上述效應(yīng)，提示LINC00152可能通過減少S期阻滯從而抵抗TMZ誘導(dǎo)的GSC細(xì)胞活力降低。本研究進(jìn)一步觀察了S期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，TMZ能誘導(dǎo)Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表達(dá)下調(diào)以及P53蛋白表達(dá)上調(diào)，而LINC00152過表達(dá)可抑制上述效應(yīng)。研究［16-17］表明，Cyclin A-CDK2是細(xì)胞S期啟動(dòng)DNA復(fù)制的重要復(fù)合物。另有文獻(xiàn)［18］報(bào)道，多柔比星可誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞S期阻滯，從分子水平上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Cyclin A、CDK2及CDC25A表達(dá)下調(diào)。還有研究［19］顯示，miR-155可通過上調(diào)P53蛋白表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯，提示本研究中的TMZ可能通過下調(diào)Cyclin A、CDK2、CDC25A蛋白表達(dá)及上調(diào)P53蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)GSC細(xì)胞S期周期阻滯，而過表達(dá)LINC00152可抑制上述效應(yīng)。

綜上所述，TMZ可通過下調(diào)Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表達(dá)及上調(diào)P53蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)GSC細(xì)胞S期阻滯。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00152可抑制TMZ誘導(dǎo)的GSC細(xì)胞P53、Cyclin A、CDC25A、CDK2蛋白表達(dá)變化及S期阻滯，這些研究結(jié)果有望為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供新的思路。但lncRNA LINC00152在腦膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能還有待于更多研究證實(shí)。