董保龍，何 雨，陳世勇，吳 彪，高 鵬,3，楊曉軍,3

1.甘肅省人民醫(yī)院普外二科，甘肅 蘭州 730000；

2.甘肅省外科腫瘤分子診斷與精準治療重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；

3.蘭州大學人民臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000

2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率和死亡率分別位居癌癥的第6位和第3位［1］。在中國其發(fā)病率和死亡率分別位居癌癥的第4位和第3位［2］。盡管近年來對HCC的治療有了很大發(fā)展，包括手術、射頻/微波消融、介入、放射性粒子植入等，但HCC患者5年生存率依然不到7%［3］。研究表明，癌基因和抑癌基因等腫瘤相關基因在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，基因治療為HCC提供了一種新的治療選擇［4］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中某些微管相關蛋白的異常表達會導致微管動態(tài)系統(tǒng)的失衡，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用［5-6］。驅動蛋白家族（kinesin superfamily，KIF）是一類調控微管運動的分子馬達，參與細胞運動、有絲分裂、細胞器運輸、細胞骨架重塑及細胞癌變過程［6］。既往研究顯示，KIF（KIF3B、KIF18A、KIF14、KIF4A、KIF20A、KIF23）的異常表達與HCC的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關［6-10］。KIF21B作為經典的驅動蛋白分子，多見于神經元細胞和免疫細胞中，其異常表達與神經退行性病變密切相關［11］。然而，目前尚未見有研究報道KIF21B在腫瘤中的表達及其作用。因此，本研究通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析KIF21B的表達差異及其與臨床病理學特征的關系；應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測HCC細胞及正常肝細胞中KIF21B的表達差異；應用免疫組織化學法進一步驗證KIF21B在HCC中的表達及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 標本收集

收集甘肅省人民醫(yī)院2014年3月—2018年6月行HCC手術切除的116例患者存檔蠟塊。所有患者均未接受化放療或射頻消融，具有完整的臨床、病理學和隨訪資料。其中男性67例，女性49例；年齡27～74歲，中位年齡57歲，≥57歲60例，＜57歲56例；腫瘤直徑≥5 cm 51例，＜5 cm 65例；乙肝病毒表面抗原（hepatitis virus B surface antigen，HBsAg）陰性48例，HBsAg陽性68例；合并肝硬化43例，無肝硬化73例；血清中甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）＞400 ng/mL 64例，≤400 ng/mL 52例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期63例，Ⅲ～Ⅳ期53例；合并有血管侵犯57例，無血管侵犯59例；總生存期（overall survival，OS）是指末次隨訪時間或死亡時間；無病生存期（disease-free survival，DFS）是指疾病復發(fā)或由于疾病進展導致患者死亡的時間。本研究通過甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

免疫組織化學KIF21B抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑購自武漢塞維爾生物科技有限公司；人HCC細胞系Huh-7和SK-Hep-1及正常肝細胞HL-7702購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。DMEM和RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自上海普飛生物技術有限公司，RTFQ-PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自美國Promega公司；KIF21B和GADPH基因引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法分析

根據(jù)試劑盒操作步驟如下：取4 μm厚石蠟包埋組織切片，二甲苯脫臘、無水乙醇（100%、85%、75%）水化；在檸檬酸抗原修復緩沖液（pH=6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復；切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光溫育25 min，阻斷內源性過氧化物酶；兔抗人KIF21B抗體（1∶100）4 ℃溫育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶200），于室溫下溫育50 min后加入DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明和中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 免疫組織化學結果分析

免疫組織化學檢測結果判斷標準：細胞質內出現(xiàn)黃色顆粒染色判定為陽性，每張切片在高倍鏡下取3個不同視野，并各計數(shù)100個細胞。染色陽性細胞比例計分：陽性細胞比例≤10%，計0分；10%＜陽性細胞比例≤25%，計1分；25%＜陽性細胞比例≤50%，計2分；陽性細胞比例＞50%，計3分。細胞染色強度強弱：無明顯染色計0分，染色淺黃色計1分，染色棕黃色計2分，染色棕褐色計3分。染色陽性細胞比例計分與染色強度強弱相乘即為免疫組織化學染色強度計分，0～1分為（-），2～3分為（+），3～4分為（++），＞4分為（+++）。計分≥2分為陽性，計分≤1分為陰性［12］。

1.3.3 RTFQ-PCR檢測KIF21B在HCC細胞系及正常肝細胞系中的基因表達

SK-Hep-1和HL-7702培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，Huh-7培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。將所有細胞置于培養(yǎng)箱中在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下進行培養(yǎng)。取對數(shù)期的細胞進行實驗。KIF21B引物序列：順義鏈為5’-GGATGCCACAGATGAGTT-3’，反義鏈為5’-TGTCCCGTAACCAAGTTC-3’。GA PD H引物序列：順義鏈為5’-T G AC T T C AACAGCGACACCCA-3’，反義鏈為5’-CACCC TGTTGCTGTAGCCAAA-3’。TRIzol法提取細胞總RNA并反轉錄為cDNA后進行后續(xù)RTFQ-PCR，反應條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，45 s；72 ℃，45 s；72 ℃，5 min；40個循環(huán)后轉為4 ℃保存，共40個循環(huán)。以GAPDH為參照，在Rotor-Gene MX3000p RTFQ-PCR儀上進行；用Rotor-Gene 6.1 software分析數(shù)據(jù)，結果采用2-ΔΔCt分析法計算。

1.4 生物信息學分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/legacyarchive/search/f）分析KIF21B在HCC組織及正常組織中的表達，選取RNAseq 及RNAseqV2的成對樣本數(shù)據(jù)進行分析。TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)存377個有可用數(shù)據(jù)的樣本，其中RNAseq樣本有371個，有50對有成對樣本數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF21B在HCC組織及正常組織中的表達情況

RNAseq 數(shù)據(jù)經過比對后，通過比對深度計算得到的原始表達量值，50 對HCC 組織中的KIF 21B 在HCC癌組織中的mRNA 表達豐度（659.90±74 4.95）顯著高于癌旁組織（129.48±139.76，P＜0.01，圖1）。

圖1 HCC與正常肝組織中KIF21B表達差異Fig.1 The differential expression of KIF21B in HCC and normal tissues

2.2 目的基因表達水平與臨床病理學參數(shù)的相關性

自TCGA數(shù)據(jù)庫檢索出377個有可用數(shù)據(jù)的樣本，其中RNAseq樣本有371個，368個有完整的T分期，347個有完整的病理學分期。Mann-WhitneyU檢驗分析顯示，KIF21B表達與T分期、病理分期相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1～2，圖2）。

表1 KIF21B表達與臨床T分期之間的關系Tab.1 The relationship between KIF21B and T stage

表2 KIF21B表達與臨床病理分期之間的關系Tab.2 The relationship between KIF21B and pathological stage

圖2 KIF21B表達與病理分期的關系Fig.2 The correlation between KIF21B expression and pathological stage

2.3 KIF21B在HCC細胞系及正常肝細胞系中的表達差異

RTFQ-PCR檢測KIF21B基因在HCC細胞系及正常肝細胞中的表達水平，結果表明，KIF21B mRNA在HCC細胞系Huh-7（ΔCt=13.64±0.062）和SK-Hep-1（ΔCt=12.82±0.190）中的表達均高于正常肝細胞HL-7702（ΔCt=16.87±0.183），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

2.4 免疫組織化學法檢測結果

免疫組織化學法檢測結果顯示，KIF21B表達于細胞質中，棕色區(qū)域為KIF21B表達位置，藍色區(qū)域為細胞核位置（圖4），依據(jù)半定量評分將患者分為KIF21B低表達組和KIF21B高表達組。HCC組織中KIF21B低表達組42例（36.2%），高表達組74例（63.8%）；癌旁組織中KIF21B低表達組102例（87.9%），高表達組14例（12.1%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 KIF21B在HCC細胞系及肝細胞系中的差異性表達Fig.3 The differential expression of KIF21B in HCC cell lines and hepatocyte lines

圖4 免疫組織化學法檢測KIF21B在HCC組織及癌旁組織中的表達Fig.4 The expression of KIF21B in HCC tissues and adjacent tissues detected by immunohistochemical analysis

2.5 KIF21B表達與HCC患者臨床病理學特征的關系

χ2檢驗分析顯示，KIF21B表達與HCC患者年齡、性別、腫瘤大小、肝硬化、血清AFP水平無明顯關系（P＞0.05），而與HCC患者TNM分期相關（P＜0.05），與HBsAg、血管侵犯顯著相關（P＜0.01，表3）。

表3 KIF21B與HCC患者臨床病理學特征之間的關系Tab.3 Correlation between KIF21B expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.6 KIF21B表達與HCC患者OS和DFS的關系

KIF21B高表達者的中位OS為26個月，低表達者為40個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004，圖5A）；KIF21B高表達者的中位DFS為21個月，低表達者為30個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.035，圖5B）。

2.7 影響HCC患者OS的危險因素

單因素分析結果顯示，腫瘤大?。≒=0.011）、血清AFP水平（P=0.015）及KIF21B表達（P=0.044）為影響HCC患者OS的因素（表4）；多因素分析結果顯示，腫瘤大?。≒=0.023）及KIF21B表達（P=0.010）為影響HCC患者OS的獨立危險因素（表5）。

圖5 KIF21B表達與HCC患者OS和DFS的關系Fig.5 The correlation between KIF21B expression and OS or DFS in HCC patients

表4 單因素分析HCC患者OS相關危險因素Tab.4 Univariate analysis of OS in 116 HCC patients

表5 多因素分析HCC患者OS相關危險因素Tab.5 Multivariate analysis of OS in 116 HCC patients

2.8 影響HCC患者DFS的危險因素

單因素結果分析顯示，年齡（P=0.024）和KIF21B表達（P=0.024）為影響HCC患者DFS的因素（表6）；多因素結果分析顯示，KIF21B表達（P=0.036）為影響HCC患者DFS的獨立危險因素（表7）。

表6 單因素分析HCC患者DFS相關危險因素Tab.6 Univariate analysis of DFS in 116 HCC patients

表7 多因素分析HCC患者DFS相關危險因素Tab.7 Multivariate analysis of DFS in 116 HCC patients

3 討 論

KIF在細胞內負責沿著微管，向其正極運送不同的分子，是細胞內小泡、細胞器、蛋白復合物和RNA等轉運的重要分子之一［13-14］。驅動蛋白與其他的分子馬達一起，以微管等細胞骨架為依托，將不同的分子運送到指定的細胞內位置，對維持細胞的基本功能具有極其重要的作用［5］。

KIF21B作為KIF中的成員之一，與強直性脊柱炎、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、糖尿病密切相關［15-18］。目前關于KIF21B的功能及相關機制研究大多集中在神經退行性疾病上。Ghiretti等［19］的研究證實，KIF21B能夠作為樹突中活性依賴性轉運和微管動力的分子調節(jié)子。然而，KIF21B在腫瘤中的研究鮮見報道。但其家族成員（KIF3B、KIF18A、KIF14、KIF4A、KIF20A、KIF23）在腫瘤中已被廣泛研究，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，KIF3B［6］、KIF18A［20］和KIF20A［21］在人HCC和HCC組織中高表達，其高表達與HCC分級和不良預后有關。

本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)KIF21B在HCC組織中的表達高于癌旁組織，并應用免疫組織化學法分析發(fā)現(xiàn)KIF21B在HCC組織及癌旁組織中的表達差異，這與前期TCGA數(shù)據(jù)庫結果一致。利用HCC組織樣本檢測KIF21B的表達發(fā)現(xiàn)，KIF21B高表達與合并乙肝感染、TNM分期和微血管侵犯密切相關（P＜0.05）；生存分析顯示，KIF21B高表達的HCC患者生存時間短且易復發(fā)；COX分析顯示，KIF21B表達狀態(tài)可作為預測HCC患者預后的獨立危險因素。大量研究表明，KIF參與了多種腫瘤進程，發(fā)揮促癌或抑癌作用，其表達水平的變化與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有直接關聯(lián)［22-24］?；贙IF3B、KIF18A和KIF20A在HCC的報道，本研究推測KIF21B高表達促進HCC患者的進展，也是術后患者OS和DFS預后的獨立危險因素。

綜上，本研究首次報道了KIF21B表達在HCC組織中明顯增加，且與預后不良密切相關，為確立以KIF21B為靶點的肝癌治療策略提供了一定的理論依據(jù)。然而，本研究也存在一些的不足之處，明確KIF21B參與HCC發(fā)生、發(fā)展的相關機制還值得深入研究。