王 淋，賈 靜，葉星明，林 露，陳燕坪，陳 穎

1.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350014；

2.福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，福建 福州 350014

腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)最新的全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增180萬的病例并且有超過88萬的死亡病例，其全球發(fā)病率和死亡率分別升至第3位和第2位［1］。hSETD1A是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases，HMT）的TrxG家族一員，其甲基化位點(diǎn)為組蛋白H3的第4位賴氨酸（lysine 4 at histone H3 tails，H3K4）［2-3］。H3K4的三甲基化（trimethylation of H3K4，H3K4me3）是基因轉(zhuǎn)錄活躍的標(biāo)志。H3K4me3通常會(huì)在激活基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)高度富集，從而控制基因的轉(zhuǎn)錄［2，4］。在針對(duì)腸癌細(xì)胞的研究中，Salz等［5］發(fā)現(xiàn)，hSETD1A能夠通過與β-catenin的相互作用而被招募到Wnt信號(hào)通路的靶基因的啟動(dòng)子上，從而調(diào)控腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。有限的實(shí)體瘤研究數(shù)據(jù)同時(shí)表明，與癌旁組織相比，腸癌、乳腺癌腫瘤組織均存在著hSETD1A mRNA高表達(dá)的現(xiàn)象，且在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)［5-6］。然而關(guān)于hSETD1A在腸癌組織中的表達(dá)情況以及與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究以直腸癌為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)法檢測直腸癌患者中hSETD1A的表達(dá)情況，分析其與直腸癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，以便為更好地評(píng)估其臨床意義、尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

141例于2012年1月—2014年6月在福建省腫瘤醫(yī)院行直腸癌手術(shù)的患者被納入該研究。為了解原始狀態(tài)的hSETD1A表達(dá)情況，所納入的研究對(duì)象均為術(shù)前未接受任何針對(duì)腫瘤治療的患者。來源于該批患者的組織蠟塊標(biāo)本（含50例癌旁正常直腸組織）及相關(guān)臨床資料、隨訪信息被用于本研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

免疫組織化學(xué)法：所有組織標(biāo)本經(jīng)3.7%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片。免疫組織化學(xué)采用瑞士羅氏公司全自動(dòng)免疫組織化學(xué)分析儀檢測，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。兔抗人SETD1A抗體（貨號(hào)PA5-54254，工作濃度1∶200）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，用已知陽性組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

hSETD1A主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽性標(biāo)記為黃色或棕黃色顆粒樣。根據(jù)切片中陽性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比評(píng)分：無腫瘤細(xì)胞陽性為0分，陽性腫瘤細(xì)胞占1%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；按照陽性強(qiáng)度評(píng)分：微弱陽性為1分，中等強(qiáng)度陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。最后總評(píng)分＝陽性百分比評(píng)分×陽性強(qiáng)度評(píng)分。0～1分為陰性；2～4分為弱-中陽性；6～9分為強(qiáng)陽性。

1.4 隨訪

病例隨訪從明確診斷開始，總生存期（overall survival，OS）的計(jì)算從確診到最后1次隨訪或死亡日期，以月為單位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析均采用IBM SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。hSETD1A表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，單因素生存曲線比較采用log-rank檢驗(yàn)；預(yù)后多因素分析采用COX回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

141例直腸癌者年齡范圍為29～86歲（中位年齡59歲），其中男性83例，女性58例。隨訪時(shí)長為1～70個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為50個(gè)月，其中因腫瘤死亡39例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版惡性腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期29例，Ⅱ期49例，Ⅲ期63例。各臨床病理學(xué)參數(shù)詳見表1。

表1 hSETD1A表達(dá)與直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 The correlation between hSETD1A expression and clinicopathological characteristics in rectal cancer

2.2 hSETD1A的表達(dá)與直腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

50例癌旁對(duì)照組織中hSETD1A陽性例數(shù)為13例（26.0%），141例直腸癌組織中hSETD1A陽性例數(shù)為106例（75.2%）（圖1）。癌組織的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。χ2分析顯示，hSETD1A陽性表達(dá)率與腫瘤的分化程度及患者的性別相關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、T分期、N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況）、TNM分期、神經(jīng)累及、脈管癌栓、CA19-9及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）表達(dá)水平無關(guān)（表1）。

2.3 hSETD1A的表達(dá)與預(yù)后分析

生存分析結(jié)果顯示，hSETD1A陽性組預(yù)后明顯比hSETD1A陰性組差（5年生存率：64.4%vs76.5%，P=0.036，圖2，表2）；hSETD1A陽性組的無病生存期（disease-free survival，DFS）低于陰性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（97.9%vs100%，P=0.407）。多因素COX回歸分析顯示，hSETD1A和T分期、N分期及后續(xù)治療可作為直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05，表3）。

圖1 hSETD1A在直腸癌中的代表性表達(dá)Fig.1 Representative sections of hSETD1A expression in rectal cancer

圖2 hSETD1A表達(dá)與直腸癌患者生存曲線圖Fig.2 Kaplan-Meier analysis for OS in rectal cancer patients according to hSETD1A protein level

表2 影響直腸癌預(yù)后的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for OS according to preoperative clinical parameters in rectal cancer

表3 影響直腸癌預(yù)后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis for OS according to preoperative clinical parameters in rectal cancer

3 討 論

hSETD1A是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，存在于人體多處組織器官中，主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，其甲基化位點(diǎn)為H3K4，主要參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。近年來，hSETD1A在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的影響作用慢慢開始受到關(guān)注，有研究［5，7-8］表明，hSETD1A的mRNA表達(dá)和蛋白水平在人肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和腸癌等多種腫瘤細(xì)胞系中明顯升高。有研究［9-10］表明，在癌癥的不同階段，無論在全身性還是局部的H3K4me3水平都會(huì)有所改變，甚至能在一定程度上作為疾病復(fù)發(fā)的預(yù)警。最近有研究［11-12］表明，SETD1A的缺失對(duì)全身性的H3K4me3水平和基因表達(dá)具有重要的影響。

本研究從臨床樣本入手，在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)hSETD1A在直腸癌組織樣本中同樣存在著高表達(dá)（106/141）的現(xiàn)象，印證了Salz等［5］前期觀察的結(jié)果。Salz等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，hSETD1A和H3K4me3的mRNA表達(dá)在多種腸癌細(xì)胞系和62.5%（15/24）的結(jié)直腸癌患者樣本中明顯上調(diào)，并且證實(shí)組蛋白H3K4me3主要是hSETD1A作用的結(jié)果。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，hSETD1A的高表達(dá)與直腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，且為其獨(dú)立的預(yù)后因素。盡管目前未見hSETD1A表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，但在一項(xiàng)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中hSETD1A的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)［6］，該結(jié)果在一定程度上印證了本研究結(jié)果。

hSETD1A與直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)，可能是通過Wnt信號(hào)通路起作用。據(jù)報(bào)道，70%～90%的結(jié)直腸癌都與Wnt信號(hào)通路的異常激活有關(guān)［13-15］。Salz等［5］研究發(fā)現(xiàn)，腸癌細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)的hSETD1A能夠通過與β-catenin的相互作用而被招募到Wnt信號(hào)通路的靶基因的啟動(dòng)子上，從而促進(jìn)啟動(dòng)子的H3K4me3并激活Wnt/β-catenin通路靶基因的表達(dá)、調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，N分期也是直腸癌獨(dú)立預(yù)后因素，這與Chen等［16］的報(bào)道一致。

Wiencke等［17］的早期研究曾發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中抑癌基因p16INK4a5’端的CpG島的甲基化與性別相關(guān)，提示在不同性別之間可能存在著基因或表觀遺傳特性的差異，進(jìn)而影響到腸癌發(fā)生、發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)程度。在真實(shí)世界中腸癌的發(fā)生率及死亡率在不同性別中也存在差異。據(jù)中國癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)道，中國男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率均高于女性［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，hSETD1A的陽性表達(dá)率與性別相關(guān)，以男性患者中陽性比例為高。這種性別的差異也許可以用激素來解釋。Slattery等［19］對(duì)結(jié)腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）的狀態(tài)與性別、生殖因素及激素暴露情況的相關(guān)性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，雌激素可能是一種能夠?qū)筂SI的保護(hù)因子；而缺乏雌激素高M(jìn)SI的年老女性結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加。我們大膽推測性別對(duì)hSETD1A組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響很可能也是由于雌激素的原因，但這需要更大樣本量的數(shù)據(jù)和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

本研究還觀察到腫瘤組織的分化程度與hSETD1A的表達(dá)相關(guān)的現(xiàn)象。由于本項(xiàng)研究中低分化程度的腫瘤樣本占比有限（僅2個(gè)），其結(jié)果可靠性還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。另一方面，雖然本研究未觀察到hSETD1A的表達(dá)與直腸癌其他臨床病理學(xué)參數(shù)（腫瘤大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、神經(jīng)累及、脈管癌栓、CA19-9及CEA表達(dá)等）的相關(guān)性，但同樣由于本研究的樣本量較少，其結(jié)果解讀亦需要審慎。

此外，本研究對(duì)象中包含了部分按現(xiàn)行美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南需要接受術(shù)前新輔助放化療的Ⅲ期腫瘤患者，這部分患者未接受該術(shù)前治療的原因多樣，包括有些主診組習(xí)慣采用歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（European Society for Medical Oncology，ESMO）指南或日本的指南，有些是因?yàn)橥饪漆t(yī)師在腸鏡下觀察能夠?qū)⑾的ね暾麆冸x，所以直接進(jìn)行手術(shù)，部分是由于患者家屬不接受，要求直接手術(shù)，情況不一。這些不一致性也可能在一定程度上影響到了hSETD1A分子在直腸癌預(yù)后價(jià)值的評(píng)估，故而其結(jié)論尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)hSETD1A在直腸癌組織中呈高表達(dá)，其陽性組生存率顯著低于陰性組，為直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。鎖定組蛋白修飾酶hSETD1A作為調(diào)控Wnt信號(hào)通路新的突破口，或許能夠?yàn)橹蹦c癌臨床研究和治療策略提供新的思路或新的治療靶點(diǎn)，其臨床應(yīng)用價(jià)值及相關(guān)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。