葉愛(ài)琴

（溫州市中醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000）

復(fù)合維生素B片是由維生素B13mg、維生素B21.5mg、煙酰胺10mg、維生素B60.2mg與右旋泛酸鈣1mg組成的復(fù)方制劑，是一種維生素類非處方藥，用于預(yù)防和治療B族維生素缺乏所致的營(yíng)養(yǎng)不良、厭食、腳氣病、糙皮病等，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是原衛(wèi)生部藥典委員會(huì)制定的藥品標(biāo)準(zhǔn)—化學(xué)藥品及制劑（第一冊(cè)），國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)中未收載有相同處方的制劑。復(fù)合維生素B片作為一種口服固體制劑，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并沒(méi)有溶出度的檢查項(xiàng)目[1]，僅有崩解時(shí)限項(xiàng)目，有文獻(xiàn)報(bào)道了復(fù)合維生素B片溶出度的研究[2]，但采用的是紫外分光光度法，方法準(zhǔn)確性的專屬性有待考察，溶出度測(cè)定結(jié)果是否能反映不同廠家產(chǎn)品的差異還值得探討。本研究采用HPLC法建立了新的溶出度測(cè)定方法，不僅對(duì)處方中難溶性的維生素B2成分進(jìn)行溶出度的測(cè)定，對(duì)不同轉(zhuǎn)速、不同溶出介質(zhì)的影響進(jìn)行了考察，對(duì)55批樣品的溶出度進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)國(guó)內(nèi)8個(gè)生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品進(jìn)行溶出曲線的考察，方法簡(jiǎn)便可靠，區(qū)分力強(qiáng)，能夠?yàn)橘|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

708DS型溶出度儀（配備850-DS取樣收集系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司），Agilent1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司，包括紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和Chemstation色譜工作站），CPA225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，十萬(wàn)分之一）。維生素B2對(duì)照品（批號(hào)：100369-201504，含量98.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供），8批復(fù)合維生素B片樣品均為質(zhì)量考核抽樣樣品，規(guī)格：復(fù)方制劑，每片含維生素B13mg、維生素B21.5mg、維生素B60.2mg、煙酰胺10mg、右旋泛酸鈣1mg（廠家a：批號(hào)18010601；廠家b：批號(hào)171004；廠家c：批號(hào)1709241；廠家d：批號(hào)20170902；廠家e：批號(hào)161105；廠家f：批號(hào)171205；廠家g：批號(hào)2171002；廠家h：批號(hào)1612006）；水為純化水，磷酸二氫銨、磷酸為分析純，庚烷磺酸鈉、乙腈為色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶出度考察對(duì)象的選擇 復(fù)合維生素B片所含的5個(gè)藥物組分中維生素B1、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣4個(gè)成分均在水中易溶，而維生素B2在水中極微溶解，即可得知本品溶出度結(jié)果取決于維生素B2這一難溶性成分的溶出情況，同時(shí)根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范[3]的要求，復(fù)方制劑的溶出度應(yīng)重點(diǎn)針對(duì)在水中微溶或不溶的活性成分，因此本研究選擇維生素B2為溶出度測(cè)定的對(duì)象。

2.2 溶液的制備 維生素B2對(duì)照品溶液：精密稱取維生素B2對(duì)照品適量，以水為溶劑加熱振搖使維生素B2溶解并稀釋制成約50μg/mL的溶液作為維生素B2對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密移取維生素B2對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。溶出介質(zhì)：①pH值1.2的緩沖液（取鹽酸4.59mL加水稀釋至1000mL）；②pH值4.3的緩沖液（中國(guó)藥典2015年版維生素B2片溶出度方法，以冰醋酸3mL與4%氫氧化鈉溶液18mL用水稀釋至600mL）[4]；③pH值6.8的緩沖液（取150mL0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液與67.2mL0.2mol/L氫氧化鈉溶液混合后，再加水稀釋至600mL，搖勻）；④水[美國(guó)藥典USP39版RiboflavinTablets（維生素B2片）溶出度方法]。供試品溶液：精密稱取樣品細(xì)粉適量（相當(dāng)于維生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水約150mL超聲處理15min，使維生素B2溶解，稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液。

2.3 溶出度測(cè)定方法的建立與驗(yàn)證

2.3.1 色譜條件：色譜柱：使用CAPCellPAKC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以含2mmol/L庚烷磺酸鈉、50mmol/L磷酸二氫銨的溶液（取庚烷磺酸鈉0.404g和磷酸二氫銨5.75g加水至1000mL，攪拌使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-乙腈（85：15）為流動(dòng)相；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：267nm；進(jìn)樣量：20μL。在本色譜條件下，輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，維生素B2峰的保留時(shí)間為8.3min，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 儀器精密度：取維生素B2對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)得維生素B2峰面積的RSD為0.04%。

2.3.3 定量限：取維生素B2對(duì)照品溶液用水不斷稀釋并進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)S/N為10左右時(shí)測(cè)得維生素B2的定量限濃度為0.01μg/mL。

2.3.4 線性關(guān)系考察：精密量取維生素B2對(duì)照品儲(chǔ)備液25mL置于50mL量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，精密量取該溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0、6.0、10.0mL分別置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為維生素B2線性考察用測(cè)定溶液。取上述線性測(cè)定溶液進(jìn)樣測(cè)定，分別以峰面積A為縱坐標(biāo)，以濃度C為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為A=96.267C-0.274，r=0.9999。由此可知，維生素B2在0.126～5.023μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（廠家c，批號(hào)1709261）細(xì)粉適量（相當(dāng)于維生素B20.5mg）置200mL量瓶中，加水約150mL超聲處理15min，使維生素B2溶解，稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。同法配制6份溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均含量為96.2%，RSD為0.8%。

2.3.6 回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（廠家c，批號(hào)1709261）細(xì)粉適量（相當(dāng)于維生素B20.25mg）9份，分別置250mL量瓶中，各精密加入維生素B2對(duì)照品貯備液1.25mL、5.0mL、7.5mL各3份，再加溶出介質(zhì)約150mL超聲15min使維生素B2溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液分別作為50%、80%、100%供試溶液，每個(gè)濃度各制備3份溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 溶液穩(wěn)定性：在避光操作條件下，按2.2.5項(xiàng)下的方法采用溶出介質(zhì)配制供試品溶液1份，分別放置0、1、2、4、6、8、10、12、24h后進(jìn)樣考察供試品溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算得出維生素B2峰面積的RSD為0.3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 溶解度試驗(yàn) 因維生素B2在水中溶解度極低，因此有必要考察其在不同pH溶出介質(zhì)中的溶解度情況。稱取維生素B2原料（上海阿拉丁公司，純度＞98%）4份，各約0.1g分別置于錐形瓶中，分別精密加入100mLpH1.2、pH4.3、pH6.8的緩沖溶液和水，密塞，避光置于恒溫振蕩器中回旋振蕩24h（恒溫溫度37℃，轉(zhuǎn)速150r/min）。取出后迅速過(guò)濾，精密取續(xù)濾液5mL分別置于100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算溶解度結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 維生素B2在37℃時(shí)不同介質(zhì)中的溶解度（μg/mL）

2.5 溶出方法的確定和溶出曲線比較

2.5.1 試驗(yàn)裝置和溶出體積的選擇：本實(shí)驗(yàn)選擇維生素B2作為溶出度測(cè)定的對(duì)象。參考國(guó)內(nèi)外維生素B2片的溶出度方法，美國(guó)藥典USP40版Ribofla-vinTablets（維生素B2片）和中國(guó)藥典2015 年版維生素B2片均采用槳法進(jìn)行溶出度的檢查，又因本品為普通片劑，故選擇槳法進(jìn)行溶出度測(cè)定。維生素B237℃在不同pH值緩沖溶液中的溶解度均約為0.1mg/mL，按本品的規(guī)格（每片含維生素B21.5mg）計(jì)算，采用體積為100mL的溶出介質(zhì)（全部溶解時(shí)的濃度約為0.015mg/mL）即可完全滿足漏槽條件，同時(shí)，結(jié)合維生素B2HPLC測(cè)定方法的靈敏度，選擇溶出介質(zhì)的體積為600mL既能滿足漏槽條件，又能適當(dāng)提高靈敏度。

2.5.2 轉(zhuǎn)速的選擇：采用槳法考察轉(zhuǎn)速的影響，取樣品（廠家c，批號(hào)1709261），采用pH值1.2的緩沖液為溶出介質(zhì)，體積600mL，分別以50、75r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行溶出試驗(yàn)，在5、10、15、20、30、45、60、90min取樣，濾過(guò)，同時(shí)補(bǔ)充溶出介質(zhì)，取續(xù)濾液作為供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制溶出曲線（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)速為50r/min時(shí)，溶出曲線上各點(diǎn)的累積溶出量均小于轉(zhuǎn)速為75r/min的累積溶出量，而到達(dá)平臺(tái)期后直至90min并沒(méi)有再繼續(xù)溶出，溶出曲線沒(méi)有與轉(zhuǎn)速為75r/min的溶出曲線相交，說(shuō)明還有部分樣品沒(méi)有溶出，50r/min的轉(zhuǎn)速不足以使片劑中維生素B2全部溶出。另外取另一個(gè)廠家的樣品（廠家b，批號(hào)171004）進(jìn)行試驗(yàn)，同法進(jìn)行試驗(yàn)也得出相同的結(jié)論。因此，本方法選擇轉(zhuǎn)速為75r/min。

圖2 不同轉(zhuǎn)速的溶出曲線（廠家c，批號(hào)1709261）

2.5.3 溶出介質(zhì)的確定：取樣品（廠家c，批號(hào)1709261），采用槳法，轉(zhuǎn)速為75r/min，體積600mL，分別在pH1.2、pH4.3、pH6.8的緩沖液和水4種溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出試驗(yàn)，按照2.5.2 的方法測(cè)定溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)圖中的溶出曲線情況可知，轉(zhuǎn)速為75r/min時(shí)在4種不同pH的溶出介質(zhì)中，兩批樣品30min時(shí)溶出曲線均能達(dá)到90%以上，各點(diǎn)溶出量均比較接近，溶出曲線大致比較相似。另外，根據(jù)前述溶解度試驗(yàn)結(jié)果，維生素B2在這4種溶出介質(zhì)中的溶解度相差不大，可以忽略，如采用水為溶出介質(zhì)，省去配制過(guò)程，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更方便快捷，USP41版維生素B2片的方法亦采用水為溶出介質(zhì)。綜合上述情況，考慮選擇水作為溶出介質(zhì)。

2.5.4 取樣時(shí)間的確定：根據(jù)上述各種溶出介質(zhì)的溶出曲線，30min時(shí)已達(dá)到平臺(tái)期，之后樣品的累積溶出量變化不大，綜合考慮，故確定取樣時(shí)間為30min。

2.5.5 管路吸附考察：取以水為溶出介質(zhì)的溶出液，在溶出曲線取樣最后一個(gè)點(diǎn)時(shí)分別進(jìn)行手動(dòng)取樣和儀器自動(dòng)取樣，結(jié)果手動(dòng)取樣和儀器自動(dòng)取樣得到樣品的峰面積一致，表明溶出儀對(duì)維生素B2無(wú)吸附。

圖3 不同溶出介質(zhì)的溶出曲線（廠家c，批號(hào)1709261）

圖4 不同廠家樣品的溶出曲線

2.5.6 溶出曲線考察：采用中國(guó)藥典2015年版四部通則中規(guī)定的槳法，以900mL鹽酸溶液（稀鹽酸24mL，加水至1000mL）為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50r/min，取8個(gè)廠家各1批樣品，按2.3.3的方法測(cè)得溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 討論

3.1 維生素B2濃度測(cè)定方法的確定 復(fù)合維生素B片含有5 個(gè)組分，因此在本研究之前建立了采用HPLC梯度洗脫同時(shí)測(cè)定5個(gè)成分的含量測(cè)定方法。因本品溶出度只需考察維生素B2，因此在上述含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，改變流動(dòng)相的比例，加快其他組分的快速洗脫，建立了維生素B2溶出度的測(cè)定方法，因此其他4個(gè)組分及輔料均對(duì)維生素B2無(wú)干擾，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均符合溶出度測(cè)定的要求。本品1片中均含維生素B2僅1.5mg，如采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，輔料或其他組分會(huì)產(chǎn)生一定的本底吸收，會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾，同時(shí)經(jīng)試驗(yàn)研究表明，原標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定方法采用分光光度法于444nm處測(cè)定維生素B2的含量，影響因素多，測(cè)定結(jié)果偏差大，不能準(zhǔn)確反映樣品的真實(shí)含量。試驗(yàn)結(jié)果顯示維生素B2水溶液在224、267、375、444nm處均有最大吸收，DAD檢測(cè)結(jié)果顯示不管在什么波長(zhǎng)處檢測(cè)，HPLC法均可以使維生素B2與輔料得到分離，檢測(cè)無(wú)干擾，但4個(gè)波長(zhǎng)中267nm處的吸光度最大，是375nm和444nm處的吸光度的3倍以上，靈敏度最高，因此選擇267nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。與文獻(xiàn)[2]的研究相比，本研究中的HPLC法專屬性更好，不受輔料及其他組分的干擾，測(cè)定結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。本方法中在避光操作條件下，供試品溶液中維生素B2在24h內(nèi)均較穩(wěn)定，說(shuō)明方法的耐用性也較好，適合溶出度的測(cè)定。

3.2 關(guān)于參比制劑的問(wèn)題及轉(zhuǎn)速和溶出介質(zhì)的選擇 復(fù)方維生素B片為復(fù)方制劑，國(guó)內(nèi)外均無(wú)法找到本品的原研制劑。因本研究中的方法只考察維生素B2這個(gè)難溶性組分的溶出情況，因此嘗試選用維生素B2的單方原研片劑-維生素B2片作為參比制劑。然而一是維生素B2原研片難以獲取，二則是對(duì)于維生素B2片，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心在2017年12月9日發(fā)布的《289目錄品種參比制劑基本情況表》中已明確“不推薦參比制劑”，原因是維生素B2片在FDA被列為OTC專論中的活性成分，橙皮書(shū)中未有收載[5]，因此本研究中沒(méi)有選擇參比制劑進(jìn)行溶出方法的研究。

在本研究溶出方法的建立過(guò)程中，因沒(méi)有合適的原研制劑作為參比制劑，所以選擇了抽樣樣品中相對(duì)來(lái)說(shuō)在國(guó)內(nèi)比較知名的、市場(chǎng)占有率較高的品牌的產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)速和溶出介質(zhì)的考察，對(duì)4種不同pH值溶出介質(zhì)均進(jìn)行了考察，以提高溶出方法的可靠性。

3.3 結(jié)果和建議 根據(jù)溶出曲線考察結(jié)果顯示，8個(gè)樣品的溶出曲線差異明顯：①?gòu)S家b樣品的溶出最快，15min溶出達(dá)到90%；②廠家a、廠家c、廠家e和廠家f4個(gè)廠家樣品的溶出曲線比較接近，30min時(shí)的溶出量均達(dá)到75%以上，只是廠家a和f前期溶出速率稍慢；③廠家d、廠家g、廠家h3個(gè)廠家的樣品前期溶出緩慢，30min溶出量均在60%及以下，溶出速率較其他5個(gè)廠家的樣品明顯偏慢，其中廠家g的樣品前期溶出較慢，但隨著時(shí)間推移溶出越來(lái)越快，而廠家h的樣品整個(gè)溶出過(guò)程溶出速率均較慢，90min時(shí)的溶出量仍不到80%，無(wú)法達(dá)到釋放平臺(tái)。此外，筆者還根據(jù)建立的溶出度方法對(duì)8個(gè)廠家的27批次樣品的溶出度進(jìn)行了檢查，以75%為限度，結(jié)果顯示有5個(gè)廠家共計(jì)7批次樣品溶出度不合格。由于無(wú)法確定原研廠家及原研制劑，各廠家產(chǎn)品的溶出曲線好壞也無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)判，有待進(jìn)一步研究，但復(fù)合維生素B片為普通崩解型速釋片劑，廠家d、廠家g、廠家h3個(gè)廠家的產(chǎn)品30min溶出量均在60%及以下，與其他5個(gè)廠家的藥品相比，溶出明顯偏慢，說(shuō)明這些廠家藥品的制劑處方及工藝相對(duì)其他廠家來(lái)說(shuō)存在一些問(wèn)題，這些廠家應(yīng)加強(qiáng)對(duì)藥品的制劑處方、原輔料、工藝的研究以及對(duì)溶出度進(jìn)行研究，以提高藥品的有效性。