袁喆晨，汪林芳，蘇芬芬，凌曉晶，陳時豪，曹佳澤，方 倩，樸正浩

(杭州師范大學醫(yī)學院，浙江 杭州 311121)

0 引言

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是引起肺炎的主要病原菌[1].因綠膿桿菌具有對多種抗菌素的耐藥性，綠膿桿菌性肺炎治療較困難，病死率較高[2-3].先天免疫系統(tǒng)是控制綠膿桿菌感染的主要防御機制，但是機體不能及時清除病原菌是導致宿主預后不良的重要因素[3-4].

中性粒細胞是先天免疫系統(tǒng)中抵抗細菌感染的主要防御細胞，在趨化因子的誘導下經(jīng)旋轉(zhuǎn)、粘附、爬行和轉(zhuǎn)移等一系列級聯(lián)反應(yīng)過程向炎癥部位募集，對侵入的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用[5-6].所以，有效地促進中性粒細胞的募集將有利于及時清除病原菌.綠膿桿菌的感染會引起中性粒細胞借助β2整合素(integrin)募集到炎癥部位[4,7].整合素是細胞的跨膜分子，主要由β2和α亞基組成，其中LFA1(αLβ2；CD11a/CD18)和Mac1(αMβ2；CD11b/CD18)為中性粒細胞的主要分子[5-6,8].中性粒細胞的Mac1通過β2整合素與內(nèi)皮細胞的表面分子相互作用，完成爬行和粘附的過程[5,9].

自噬(autophagy)是對胞質(zhì)蛋白和細胞器進行降解的一種過程，對穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境具有十分重要的作用[10-11].在腫瘤細胞中自噬能夠激活整合素，增加細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，并促進細胞的轉(zhuǎn)移[12-13].在中性粒細胞中，自噬可以促進細胞脫顆粒[14]、殺菌和形成細胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap, NET)[15]，還可以促進中性粒細胞的分化及中性粒細胞成熟標志CD11b/CD18的表達[16].但自噬是否能調(diào)節(jié)中性粒細胞的募集還不清楚.

本研究通過分離小鼠骨髓中性粒細胞進行了體外的粘附實驗，以了解自噬在綠膿桿菌感染時對中性粒細胞粘附的作用，進而為探索自噬在中性粒細胞募集中的作用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

3-甲基腺苷(3-methyladenine，3-MA)(HY-19312)購于MedChem Express；胎牛血清(11012-8611)購于四季青；紅細胞裂解液(C3702)購于Beyotime Biotechnology；PecrollTM(10245267)購于Bioleaf Biotech；4%多聚甲醛固定液(E672002)購于BBI Life Sciences；BSA封閉液(C500036-0250)和30%的聚丙烯乙酰胺(B546018-0500)購于Sangon Biotech；RPMI1640(MA0215)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(MA0082)購于Meilun Biotech；β-actin(#3700)和LC3A/B(#4108)抗體購于Cell Signaling Technology；CD11b-PE(12-0112)和CD18-FITC(11-0181)流式細胞儀熒光抗體購于eBioscience；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0100)購于MILLIPORE.

1.2 小鼠骨髓中性粒細胞的提取

提取C57BL/6野生型小鼠大腿骨，用注射器抽取培養(yǎng)液反復灌洗骨髓，離心后收集骨髓細胞.用紅細胞裂解液裂解其中的紅細胞，用1×PBS終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5 min收集細胞.細胞用0.5 mL 1×PBS 混懸，小心置于已制備好的Percoll細胞分離液中，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速4 ℃離心30 min，并去除減速自然停止.離心結(jié)束后可見分層，取第三層細胞，用無菌的1×PBS洗滌兩次，通過FACS檢測中性粒細胞的百分比(CD11b/Gr1).

Percoll密度梯度分離液的制備：取100%的Percoll(按9∶1的比例混合Percoll原液和10×PBS)，用1×PBS稀釋成80%、65%、50%的3種Percoll液體，分別以體積4、3、3 mL依次緩慢加入一支15 mL離心管中，制作濃度梯度.

1.3 免疫印跡實驗

按常規(guī)方法收集各組處理后的細胞，每組細胞加100 uL RIPA細胞裂解液(加磷酸酶抑制劑和1 mmol/L PMSF)，在冰上裂解30 min后，收集裂解液在12 000 r/min條件下離心30 min，收集上清的蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度.取等量的各組蛋白質(zhì)，加1×的上樣緩沖液，于100 ℃條件下煮蛋白5 min，獲得最后的蛋白樣品.在12%的SDS-PAGE膠中每孔加入40 μg蛋白樣品，利用伯樂電泳系統(tǒng)進行電泳，設(shè)置電壓為100 V，電泳90 min.電泳完成后，在100 V的電壓條件下轉(zhuǎn)膜60 min.膜用BSA封閉液封閉60 min，然后4 ℃孵育一抗過夜.次日，用1×TBST在搖床上洗膜(每次5 min，共3次).在室溫孵育二抗2 h后，用1×TBST緩沖液洗膜，最后用辣根過氧化物酶底物反應(yīng)后，在暗室顯影和定影.

1.4 細胞粘附實驗

提取的骨髓中性粒細胞接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板中，用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時間后，去除上清液中的未貼壁細胞，并用1×PBS洗一次培養(yǎng)板.每孔加入適量的1×PBS刮貼壁的細胞，收集細胞并計數(shù)為粘附細胞的數(shù)量.

1.5 流式細胞術(shù)

提取骨髓中性粒細胞，用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時間后收集全部細胞(懸浮和貼壁的細胞)，用1×PBS清洗細胞.加入CD11b-PE和CD18-TIFC熒光抗體2 μL(抗體稀釋100倍)4 ℃避光孵育細胞15 min.再用1×PBS清洗一次細胞后，加入200 μL 4%多聚甲醛固定液固定細胞，用流式細胞儀觀察中性粒細胞整合素CD11b和CD18的熒光強度.

2 結(jié)果

2.1 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細胞的粘附，增強整合素CD11b/CD18的表達

提取小鼠骨髓中性粒細胞，分成4組，每組細胞數(shù)量為5.1×105個.接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板上，再用綠膿桿菌PA14菌株(MOI 25)感染細胞10、30、60 min后，去除上清液中未貼壁的細胞，清洗一次培養(yǎng)板后刮取貼壁的細胞并計數(shù).0組為沒有感染的實驗組，每組3個復孔，實驗重復3次.

圖1 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細胞的粘附
Fig.1Pseudomonasaeruginosapromotes the adhesion of neutrophils

中性粒細胞是先天免疫系統(tǒng)中抵抗細菌感染的主要防御細胞，募集到感染部位發(fā)揮抗感染的作用，而粘附是中性粒細胞募集級聯(lián)反應(yīng)過程中的一個必經(jīng)階段[5-6].在綠膿桿菌感染時中性粒細胞依賴β2整合素募集到感染部位[4].本課題組分離了小鼠骨髓中性粒細胞，感染綠膿桿菌進行研究時發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞的粘附細胞數(shù)量隨著感染時間的延長而增多，在30 min時粘附的細胞數(shù)量達到頂峰(圖1).整合素是中性粒細胞發(fā)揮功能所需的跨膜蛋白[5-6]，綠膿桿菌感染后中性粒細胞表面整合素CD11b/CD18的表達也增加(圖2).由此確定，綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細胞的粘附和整合素CD11b/CD18的表達增強.

A、B：提取小鼠骨髓中性粒細胞，平均分成4組，每組細胞數(shù)量為5.5×105個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60 min，收集細胞后用流式細胞儀檢測CD11b的熒光強度，并制作折線圖分析趨勢.實驗重復3次.

C、D：提取小鼠骨髓中性粒細胞，平均分成4組，每組細胞數(shù)量為5.5×105個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60 min，收集細胞后用流式細胞儀檢測CD18的熒光強度，并制作折線圖分析趨勢.實驗重復3次.

圖2 綠膿桿菌感染增強整合素CD11b/CD18的表達
Fig.2Pseudomonasaeruginosaenhances the expression of integrin

2.2 綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細胞自噬的發(fā)生

自噬調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能，參與細菌感染的炎癥反應(yīng)[4,17].在腫瘤細胞中自噬能夠激活整合素，增加細胞粘附并促進細胞的轉(zhuǎn)移[12-13].為了研究中性粒細胞的粘附機制，本研究通過免疫印跡實驗觀察了自噬標記性分子LC3-I/II的表達，發(fā)現(xiàn)隨著綠膿桿菌感染時間的增加，LC3-II蛋白的表達增加(圖3A).3-MA是自噬的抑制劑[18]，用3-MA預先處理骨髓中性粒細胞后感染綠膿桿菌發(fā)現(xiàn)，LC3-II的表達明顯被抑制(圖3B).可見，綠膿桿菌感染可引起中性粒細胞的自噬.

A：提取野生型小鼠的骨髓中性粒細胞，平均分成4組，每孔細胞數(shù)量為2.6×106個.用綠膿桿菌(MOI 25)感染10、30、60、120 min后獲取蛋白，每孔蛋白量為40 μg左右.進行免疫印跡實驗，觀察LC3-I/II和Actin.

B：從小鼠的骨髓中分離骨髓中性粒細胞，每孔細胞數(shù)量為2.1×106個，3-MA抑制劑組預先處理1 h(濃度分別為10、50、100、200 μmol/l).清洗細胞后用綠膿桿菌(MOI 25)感染細胞60 min.獲取蛋白，每孔蛋白量為40 μg左右，并進行免疫印跡實驗觀察LC3-I/II的表達.

圖3 綠膿桿菌感染激活骨髓中性粒細胞中自噬的發(fā)生
Fig.3Pseudomonasaeruginosainduces autophagy in neutrophils from bone marrow

2.3 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時骨髓中性粒細胞的粘附和整合素的表達

提取小鼠的骨髓中性粒細胞，每孔細胞數(shù)量為2.9×106個.預先用3-MA(200 μmol/L)或DMSO處理后清洗一次細胞，接種在涂有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)板上，再用綠膿桿菌(MOI 25)感染不同時間，觀察粘附細胞的數(shù)量.0組為沒有感染的組.

圖4 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時骨髓中性粒細胞的粘附
Fig.4 Autophagy regulates the adhesion of neutrophils duringPseudomonasaeruginosainfection

為了確定自噬對中性粒細胞粘附的作用，用3-MA抑制劑預先處理骨髓中性粒細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬的抑制劑顯著地抑制中性粒細胞的粘附(圖4).CD11b是中性粒細胞執(zhí)行功能的重要分子，在缺乏自噬的細胞中的表達顯著地降低[16].本研究發(fā)現(xiàn)自噬的抑制劑3-MA抑制整合素CD11b的表達(圖5A、B)，但是CD18的表達幾乎沒有被抑制(圖5C、D).因此，可以確定自噬在骨髓中性粒細胞的粘附和整合素的表達中起重要作用.

3 討論

綠膿桿菌廣泛分布于自然界，常在醫(yī)院內(nèi)引起感染，而且具有對多種藥物的耐藥性，所以治療困難[1,19].綠膿桿菌感染引起中性粒細胞的募集[7]，從骨髓經(jīng)旋轉(zhuǎn)、粘附、爬行和轉(zhuǎn)移一系列過程募集到炎癥部位[5-6].已有文獻報道，在綠膿桿菌感染時中性粒細胞借助β2整合素募集到感染部位[4]，整合素是中性粒細胞執(zhí)行功能的重要跨膜蛋白[5-6,8].本研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌感染引起小鼠骨髓中性粒細胞的粘附，同時增強整合素CD11b和CD18的表達.

A、B：提取小鼠的骨髓中性粒細胞，每組細胞數(shù)量為7.2×105個.3-MA(200 μmol/L)或DMSO預處理后清洗一次細胞，感染綠膿桿菌(MOI 25).收集各組細胞后通過流式細胞術(shù)檢測CD11b的熒光強度，并制作折線圖觀察變化趨勢.實驗重復3次.

C、D：提取小鼠的骨髓中性粒細胞，每組細胞數(shù)量為7.2×105個.3-MA(200 μmol/L)或DMSO預處理后清洗一次細胞，感染綠膿桿菌(MOI 25).收集各組細胞后通過流式細胞術(shù)檢測CD18的熒光強度，并制作折線圖觀察變化趨勢.實驗重復3次.

圖5 自噬調(diào)節(jié)綠膿桿菌感染時整合素的表達
Fig.5 Autophagy regulates the expression of integrin duringPseudomonasaeruginosainfection

自噬在腫瘤細胞中激活整合素，并促進細胞的轉(zhuǎn)移[12-13].在中性粒細胞中自噬可以促進細胞脫顆粒、分化、殺菌等作用[14-16]，但對中性粒細胞募集的影響還沒有文獻報道.已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以促進中性粒細胞成熟標志CD11b/CD18的表達[16].CD11b/CD18是中性粒細胞遷移和激活必不可少的重要分子[5,20].本研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌感染引起骨髓中性粒細胞的自噬，而且自噬的抑制劑3-MA顯著地抑制細胞CD11b的表達和中性粒細胞的粘附.

綜上所述，綠膿桿菌感染可以激活骨髓中性粒細胞的自噬，而且自噬的抑制劑抑制細胞中整合素CD11b的表達和粘附.本研究確定自噬參與中性粒細胞的粘附，但是否促進中性粒細胞的募集尚不清楚，需進一步研究.