韓鵬勃，蔣 鋒，劉 柱，姚亞波

1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(西安 710038)；2.陜西省友誼醫(yī)院(西安 710068)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病變，多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性，主要表現(xiàn)為低骨量、骨微結(jié)構(gòu)破壞，是導(dǎo)致骨脆性增加、強(qiáng)度降低，易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病[1]。近年來(lái)，我國(guó)人口老齡化進(jìn)程加速，OP發(fā)病率、致殘率和死亡風(fēng)險(xiǎn)逐年增高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。因此，積極防治OP現(xiàn)已成為醫(yī)療關(guān)注的重點(diǎn)之一。中醫(yī)藥治療在我國(guó)已有悠久的歷史，具有辨證論治、防重于治、療效佳、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，安全性及可行性較高[3]。據(jù)報(bào)道，加味身痛逐瘀湯在骨質(zhì)疏松癥的治療中具有良好的臨床療效，可明顯減輕患者癥狀[4-6]，但其在OP防治中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)根據(jù)既往研究報(bào)道，骨代謝過(guò)程涉及信號(hào)傳導(dǎo)通路、遺傳基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控及激素等,其中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨發(fā)育、骨形成及骨代謝等生理過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]；Wnt通路可通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖及分化進(jìn)而增加骨量，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡[8]。且研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與骨質(zhì)疏松的發(fā)生及緩解密切相關(guān)，其異常表達(dá)會(huì)造成骨形成障礙，進(jìn)而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[9]?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)建立去卵巢大鼠模型作為骨質(zhì)疏松癥研究對(duì)象，給予加味身痛逐瘀湯進(jìn)行灌腸干預(yù)，通過(guò)觀察其骨密度變化、股骨病理形態(tài)改變及股骨組織中 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化，探究加味身痛逐瘀湯對(duì)OP的防治作用機(jī)制，以期為OP的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和參考。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取60只成年健康雌性SD大鼠，SPF級(jí)，平均體質(zhì)量(245±25) g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物：加味身痛逐瘀處方組成，當(dāng)歸 、茯苓、川牛膝各20 g，秦艽、紅花、川芎、桃仁、地龍各10 g，香附、羌活、五靈脂、蒼術(shù)、杜仲、白芍各15 g，黃芪、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)各30 g，甘草5 g。所有藥材均購(gòu)自西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，常規(guī)水煎。大鼠給藥劑量換算方法參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，大鼠等效劑量按照成人劑量的6.3倍計(jì)算，給藥容積0.5 ml/100g，加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量分別為 32、16、8 g /kg。

水合氯醛購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，戊酸雌二醇片購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，青霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司，Wnt 、β-catenin和β-actin抗體購(gòu)自Gene Tex，Wnt1和cyclin D1抗體購(gòu)自 Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型的建立：采用摘除雙側(cè)卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥大鼠動(dòng)物模型。給予實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠40 g/L水合氯醛(3 μg/g體質(zhì)量)，左側(cè)腹腔肌肉注射麻醉，俯臥位固定，于腰背部脊柱兩側(cè)作縱行切口充分暴露卵巢組織，后結(jié)扎完整摘除兩側(cè)卵巢組織，縫合切口。假手術(shù)組同上暴露卵巢但不予以摘除，造模術(shù)后均給予青霉素防感染。

2.2 分組及給藥：實(shí)驗(yàn)大鼠按體重隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，戊酸雌二醇組，加味身痛逐瘀湯高劑量組、中劑量組和低劑量組各10只。于造模成功后2個(gè)月給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片(0.09 μg/g 體質(zhì)量)；加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量組分別給予32、16、8 g/kg 體質(zhì)量湯劑。各組均于上午 9:00 準(zhǔn)時(shí)灌胃給藥，1 d/1次，連續(xù)2個(gè)月。

2.3 取材：各組大鼠末次給藥灌胃后禁食24 h，稱重給予水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，取大鼠腹主動(dòng)脈血液，離心取血清備用。處死各組動(dòng)物，剝離肌肉、結(jié)締組織，取大鼠左右側(cè)股骨經(jīng)生理鹽水沖洗，錫紙包裹，-80 ℃凍存，以供后續(xù)檢測(cè)。左側(cè)股骨做 HE 染色，用于組織病理形態(tài)的觀察，右側(cè)股骨做Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)的測(cè)定。

2.4 骨密度測(cè)定：采用美國(guó)NORLAND雙能 X 線骨密度儀測(cè)量各組大鼠左右肢股骨骨密度，掃描速度70 mm/s，掃描寬度15 cm，以單位面積內(nèi)骨礦物質(zhì)含量(g /cm2) 表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。

2.5 股骨組織病理形態(tài)改變：取各組大鼠左股骨組織標(biāo)本，多聚甲醛固定液固定，10% EDTA(pH 7.4)溶液脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋5 μm切片；60 ℃烤片，行股骨石蠟切片常規(guī) HE染色，中性樹(shù)膠封片，于倒置顯微鏡下觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài)，拍照記錄。

2.6 股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定：取各組大鼠右股骨組織標(biāo)本，液氮研磨破碎，加入RIPA 裂解液提取總RNA，測(cè)定其濃度。取80 μg變性蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h，加入一抗 Wnt(1∶1000)、Wnt1(1∶1000)、β-catenin(1∶2000)、cyclin D1(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育 1 h， ECL顯色，使用Azurec500化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照記錄。使用 Image-J 圖像分析軟件分析各目標(biāo)條帶灰度值，以 β-actin 為內(nèi)參，進(jìn)行半定量結(jié)果分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠骨密度檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 對(duì)比顯示，模型對(duì)照組大鼠股骨骨密度值較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組、加味身痛逐瘀湯高劑量組、中劑量組和低劑量組股骨骨密度值均顯著升高(P<0.05)，但程度不一，戊酸雌二醇組升高較明顯，加味身痛逐瘀湯高劑量組其次。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠骨密度值比較(g /cm2)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05

2 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)對(duì)比 光鏡下，假手術(shù)組大鼠骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰、排列有序，基本結(jié)構(gòu)正常；模型對(duì)照組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)明顯異常，表現(xiàn)為骨小梁斷裂、不完整、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失；加味身痛逐瘀湯低、中劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯斷裂。較模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和加味身痛逐瘀湯高劑量組骨小梁病理變化明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)排列較規(guī)則有序，接近正常(圖 1)。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)(HE染色，×20)

3 各組大鼠股骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)比 研究為明確各組大鼠股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)情況，故采用Western blot法對(duì)各組相關(guān)蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)表2。模型對(duì)照組大鼠股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)含量較假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)；戊酸雌二醇組、加味身痛逐瘀湯高、中、低劑量組股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)含量均較模型對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，且加味身痛逐瘀湯高劑量組蛋白表達(dá)量升高最為顯著(圖2)。

表2 各組大鼠骨股組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05

注：1假手術(shù)組；2模型對(duì)照組；3戊酸雌二醇組；4加味身痛逐瘀湯高劑量組； 5加味身痛逐瘀湯中劑量組；6加味身痛逐瘀湯低劑量組

圖2 各組大鼠股骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

OP是由多種因素引起的以低骨量、骨微結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕卣鞯某Ｒ?jiàn)骨代謝性疾病，一般分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類(lèi)，多見(jiàn)于絕經(jīng)后女性和老年男性，其導(dǎo)致的骨強(qiáng)度減弱、易骨折等嚴(yán)重影響中老年人群的生活質(zhì)量，現(xiàn)已受到醫(yī)學(xué)界重視，并將其列為三大老年病之一[10]。資料顯示[11-13]，骨代謝過(guò)程中骨形成和骨代謝偶聯(lián)失衡，致使骨密度降低是OP的基本發(fā)病機(jī)制；且認(rèn)為OP與機(jī)體內(nèi)分泌紊亂、降鈣素缺失及甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素和糖皮質(zhì)激素等分泌異常密切相關(guān)。目前，臨床采用有效的藥物治療如雌激素代替療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素及抑制骨吸收藥和促進(jìn)骨形成藥等阻止、治療OP，患者病情暫時(shí)得到緩解，但普遍存在依從性差、藥物過(guò)敏等副作用，多數(shù)患者仍遭受病痛的折磨[14]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在OP治療臨床和實(shí)驗(yàn)中取得了較好成效，其辨證論治、防重于治，在提高療效的同時(shí)藥物毒副作用小，且具有較高安全性及可行性。因此，探尋有效的OP中醫(yī)藥方劑及機(jī)制，具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

中醫(yī)理論認(rèn)為，根據(jù)臨床特征及發(fā)病特點(diǎn)可將OP歸屬于“骨枯”、“骨痹”、“骨痿”等范疇，并認(rèn)為腎精虧虛是OP的主要病因[15]。據(jù)《醫(yī)經(jīng)精義》記載：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之合也”。脾腎虧虛為本，血瘀為要，“虛”、“瘀”相互影響、互為因果。脾腎兩虛導(dǎo)致整體機(jī)能減退，氣不能行血，出現(xiàn)瘀阻脈絡(luò)，“不通則痛”，故臨床上OP患者大多以腰背疼痛就診。而脈絡(luò)瘀阻，精微氣血不暢，導(dǎo)致脾腎虧虛，骨失所養(yǎng)，生髓乏源，進(jìn)而加速OP發(fā)生。因此，臨床上對(duì)OP的治療主要以活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)骨為原則，且臨床試驗(yàn)表明，補(bǔ)腎中藥可增強(qiáng)骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，促進(jìn)骨中礦物質(zhì)沉積，進(jìn)而阻抗OP發(fā)生。加味身痛逐瘀湯為王清任創(chuàng)制的名方[16]，方中川芎、桃仁、當(dāng)歸、紅花等活血化瘀，可降低血液黏稠度，改善血管微循環(huán)和通透性，促進(jìn)修復(fù)及再生；五靈脂、香附等活血行氣，疏肝解郁，抗炎，散瘀止痛；羌活、秦艽等解熱鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)濕，舒經(jīng)脈；川牛膝、杜仲等活血通經(jīng)，補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋骨；地龍舒筋利血脈，黃芪補(bǔ)中益氣，茯苓利水消腫；甘草調(diào)和諸藥，共為佐使，同時(shí)配以續(xù)斷、骨碎補(bǔ)活血續(xù)筋、補(bǔ)腎強(qiáng)骨。全方共奏活血化瘀、通痹止痛、補(bǔ)腎之功效。袁菱梅等研究發(fā)現(xiàn)[4]，電針結(jié)合加味身痛逐瘀湯，可明顯緩解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。陳魯峰等[6]在老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的臨床中藥治療中發(fā)現(xiàn)加味身痛逐瘀湯能明顯改善臨床療效，提高患者骨密度。此外，現(xiàn)代藥理研究表明[17]，方中骨碎補(bǔ)能提高堿性磷酸酶活性，抑制破骨細(xì)胞骨吸收，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，利于骨鹽和骨鈣化的形成，增加骨密度。同時(shí)中藥能夠調(diào)控骨生長(zhǎng)因子，提高骨磷、骨鈣、骨膠原含量，通過(guò)增加骨密度進(jìn)而改善骨生物力學(xué)性能，利于骨折愈合[18]。因此本課題通過(guò)切除大鼠雙側(cè)卵巢構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型，研究加味身痛逐瘀湯對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果，結(jié)果顯示，去卵巢后大鼠BMD 下降，骨微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞呈現(xiàn)出明顯的 OP 癥狀，表明去除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型成功。而加味身痛逐瘀湯干預(yù)去卵巢大鼠 4 周后，能明顯升高其骨密度，抑制骨微結(jié)構(gòu)的破壞，表明加味身痛逐瘀湯對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療效果，戊酸雌二醇組和高劑量加味身痛逐瘀湯的防治效果最佳，但臨床上患者可能對(duì)西藥過(guò)敏及其他副作用導(dǎo)致效果不佳，而加味身痛逐瘀湯能有效緩解骨質(zhì)疏松癥，且因其沒(méi)有藥物副作用，在臨床上可廣泛應(yīng)用。

據(jù)國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道，成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖分化受Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控，在OP中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，有關(guān)骨代謝的研究中Wnt/β-catenin通路較為深入，認(rèn)為該通路在骨代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。韓學(xué)明等[19]研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)β-catenin的表達(dá)量明顯低于正常老年女性，表明Wnt/β-catenin通路可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。沈霖等[20]利用具有補(bǔ)腎滋陰功效的青蛾丸治療 80 例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者，發(fā)現(xiàn)青娥丸能夠維持絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨密度，其部分療效機(jī)制與其可增強(qiáng)患者β-catenin表達(dá)和抑制DKK-1水平有關(guān)。成鵬等[21]在去卵巢大鼠的OP癥中研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠有效緩解氧化應(yīng)激介導(dǎo)的OP，可能與其調(diào)控Wnt2/β-catenin 通路，降低骨代謝水平，減少骨吸收作用相關(guān)。Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1等蛋白是調(diào)控 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，其高表達(dá)表明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活。本研究測(cè)定了大鼠股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加味身痛逐瘀湯干預(yù)去卵巢大鼠后促進(jìn)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，由此可以推斷加味身痛逐瘀湯可能通過(guò)正向調(diào)控 Wnt/β -catenin 信號(hào)通路，提高骨密度，改善骨組織形態(tài)，對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有治療效果。