唐志遠　王雪玲　劉可星

摘要：為構建一種具有高效降解油脂能力的復合菌劑，以大豆油為唯一碳源，通過單因素試驗，研究接種量、初始pH值、溫度、初始大豆油含量等因素對復合菌劑降解油脂性能的影響。結果表明，以3%的接種量為最佳接種量，復合菌劑能耐受較大范圍的pH值變化，復合菌劑降解油脂的最佳溫度為30 ℃，初始含油量為0.10% 時，油脂降解效率最高。因此，復合菌劑降解油脂的最佳條件是：接種量為3%、溫度為30 ℃、pH值為7.0、初始含油量為0.1%，在此條件下，油脂降解率為96.43%。

關鍵詞：復合菌劑;生物降解;油脂;接種量;含油量;優(yōu)化

中圖分類號： X703;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0269-04在我國居民生活與消費水平日益提高的背景下，肉類、牛奶加工業(yè)及餐飲業(yè)快速發(fā)展，但這類產(chǎn)業(yè)引發(fā)的環(huán)境問題不容忽視，油性廢水排放是其中較為突出的問題。油性廢水的危害主要有直接排放油性廢水會引發(fā)油脂在水表面上形成一層膜，降低水體的復氧能力及自凈能力，危害水體生態(tài)環(huán)境[1-2];油性廢水易產(chǎn)生刺激性味道，容易堵塞管道[3];傳統(tǒng)活性污泥法處理含油廢水效果差，主要是由于污泥被油脂包裹，降低了傳質效率，進而影響對廢水的處理效果[4-6]。目前，有效解決這一技術性問題的有效途徑是采用除油器將廢水中的大部分油脂分離出來，進行微生物處理。

微生物可將油脂作為碳源與能源物質，通過自身的生長繁殖消除油脂污染，且利用微生物處理油性廢水具有操作簡便、成本低和不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點[7]。相關研究表明，目前用來研究微生物處理油性廢水的菌株主要是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、酵母菌和芽孢桿菌（Bacillus sp.）[8-10]。目前，國內外多采用單一菌株研究微生物降解油性廢水的性能，而關于復合菌劑降解油性廢水的研究較少。相關研究表明，復合菌劑中的菌株之間具有較好的協(xié)同作用，對成分復雜的油脂具有較強的降解能力[11]。本研究以大豆油為唯一碳源，構建對油脂具有較強降解能力的復合菌劑，并優(yōu)化其降解條件，皆在為復合菌劑在微生物處理油脂廢水中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、假絲酵母菌（Candida tropicalis）、解朊假絲酵母菌（Candida famata），保藏于華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、pH值7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫熱滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、pH值自然、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫熱滅菌20 min。

降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 0.2 g、K2HPO4 2.0 g、KH2PO4 2.0 g、NaCl 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、豆油1.0 mL、pH值7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫熱滅菌20 min。

1.3 種子液培養(yǎng)

分別挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，接種到LB培養(yǎng)基中，分別挑取假絲酵母菌、解阮假絲酵母菌，接種到PDA培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后，各發(fā)酵液中菌種數(shù)量均高于1×107 CFU/mL。

1.4 單一菌種油脂降解能力試驗

分別將種子液以1%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中，以不加種子液的降解培養(yǎng)基作為空白對照，在溫度為30 ℃、轉速為150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后，測定油脂濃度并計算降解率。

1.5 復合菌劑的構建

用平板測定法測定上述4種菌株間的拮抗作用[12]。

1.6 優(yōu)化復合菌劑降解油脂的條件

將“1.3”節(jié)中的4種種子液等比例混合制成復合菌劑。按以下條件進行油脂降解性能優(yōu)化試驗：將復合菌劑按0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中，置于30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h 后，測定油脂濃度并計算降解率;將復合菌劑以最佳接種量接種至初始pH值分別為5、6、7、8、9的降解培養(yǎng)基中，置于溫度為30 ℃、150 r/min 搖床中培養(yǎng)72 h后，測定油脂濃度并計算降解率;將復合菌劑以最佳接種量接種至降解培養(yǎng)基中，分別置于溫度為20、25、30、35、40 ℃，轉速為150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后，測定油脂濃度并計算降解率;將復合菌劑以最佳接種量接種至具有最佳初始pH值的降解培養(yǎng)基中，分別添加0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%大豆油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)溫度下150 r/min培養(yǎng)72 h后，測定油脂濃度并計算降解率。

1.7 測定方法

采用紫外分光光度法[13]測定油脂含量，并計算油脂降解率。以大豆油為溶質，經(jīng)純化的石油醚為溶劑，準確地配制濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL/mL的系列標準樣品，用紫外分光光度計，在225 nm處，依次測定上述系列標準樣品的吸光度，并繪制標準曲線。通過以下公式計算油脂降解率。

油脂降解率=（C0-C）/C0×100%。

式中：C0為培養(yǎng)基的原始含油量;C為油脂降解后的培養(yǎng)基含油量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行處理，采用SPSS 19.0進行Duncans多重比較分析，并采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 單一菌種油脂降解能力

分別將4個菌種的種子液接種至降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，測定含油量，計算油脂降解率。大豆油標準曲線見圖1，回歸方程為y=0.442x+0.006，r2=0.999 3。大豆油標準曲線的回歸方程滿足檢測要求，因此可定量測定廢水中油脂的含量。不同菌種間對大豆油的降解能力有差異（表1）。與對照（CK）相比， 4個菌種的油脂降解率達到顯著性差異水平，降解率均在60%以上，表明4個菌種均對大豆油具有降解能力。

2.2 復合菌劑的構建

拮抗試驗結果（表2）表明，4個菌種間無明顯拮抗作用。在實際應用中，復合菌劑的抗干擾能力較強，可以在環(huán)境中形成優(yōu)勢菌群，提高對油脂的降解能力。因此本試驗利用4個菌種構建復合菌劑。

2.3 不同接種量對油脂降解的影響

合適的菌劑投加量，可在節(jié)省資源的同時，提高對油脂的降解效率和降解能力。從圖2可以看出， 在一定范圍內接種量與油脂的降解率呈顯著性相關關系，表明油脂降能力與接種量有關。在0.5%接種量處理條件下，復合菌劑降解油脂的效率比較緩慢，隨著接種量的增加，油脂降解率顯著增加，但當接種量超過3%后，油脂降解率沒有顯著增加。由此可見，最優(yōu)接種量為3%，此時油脂降解率為81.97%。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對油脂降解的影響

微生物的生長對環(huán)境的pH值有一定的要求，偏酸或偏堿都會對微生物的生長繁殖產(chǎn)生影響。不同初始pH值對復合菌劑降解油脂的影響見圖3，可以看出，pH值變化對復合菌劑降解油脂的能力影響較弱，在不同pH值條件下，復合菌劑的油脂降解率均在81%～83%之間，且差異較小，表明復合菌劑能耐受較大范圍的pH值變化，因此降解培養(yǎng)基的初始pH值選擇7.0。

2.5 溫度對復合菌劑降解油脂的影響

溫度是影響微生物生長繁殖的主要因素之一，在合適的條件下，微生物生長繁殖的速度能夠加快。從圖4可以看出，在不同溫度條件下，復合菌劑降解油脂的能力具有顯著性差異。當溫度為30 ℃時，復合菌劑降解油脂的能力最強，油脂降解率為82.57%，表明該溫度是復合菌劑生長繁殖的最適溫度，因此選擇最適溫度為30 ℃。

2.6 初始含油量對復合菌劑降解油脂的影響

合適的碳氮比能加快微生物的生長，提高微生物利用碳源的能力。從圖5可以看出，當初始含油量高于0.10%時，油脂降解率出現(xiàn)下降的趨勢，表明初始含油量為0.10% 時，復合菌劑利用碳源的能力最強，對應油脂降解率為96.43%，因此選擇合適初始含油量為0.10%。

3 結論與討論

本研究通過單一菌種的油脂降解與拮抗試驗成功構建出一種復合菌劑，并以大豆油為唯一碳源進行單因素試驗，試驗結果表明，復合菌劑的最佳降解油脂的最佳條件是：接種量為3%、溫度為30 ℃、pH值為7.0、初始含油量為0.10%，在此條件下，油脂降解率為96.43%。

[CM（20]目前，對油性廢水采用的處理方法主要有物理法、化學法、物理化學法和生物方法。微生物菌劑處理是一種高效處理油性廢水的工藝，通過直接向油性廢水中投加微生物來降解油脂。油性廢水性質復雜，水質變化較大，因此投加的菌劑需要有較強的耐受能力。與單一菌劑相比，投加復合菌劑在油性廢水中具有更好的優(yōu)勢。復合菌劑能夠提高自身的競爭力，成為優(yōu)勢菌群，且可通過不同微生物的協(xié)調作用，提高對油脂的降解能力[14-15]。但油性廢水理化性質復雜，不同環(huán)境條件可對復合菌劑降解油脂的能力造成影響。

本研究構建的復合菌劑具有高效的油脂降解能力，在最佳降解條件下培養(yǎng)72 h后油脂降解率高于90%。不同單一菌種降解油脂的能力有較大區(qū)別，游游等篩選得到的菌株，在一定條件下的油脂降解率為87.55%[6]。張印等篩選得到的菌種，在一定條件下對油脂的降解率僅為68.2%[16]。李文君等篩選得到的菌株JZZ2對不同類型的油脂表現(xiàn)出不同的降解能力[17]。在污水處理中投加單一菌種具有較大的局限性，而投加復合菌劑在污水處理中具有更好的處理效果。

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