原紅娟　朱紅惠

摘要：為探索不同植被根際可培養(yǎng)黏細(xì)菌與未培養(yǎng)黏細(xì)菌的多樣性，采用傳統(tǒng)的輔助菌誘導(dǎo)方法，對樣品的黏細(xì)菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)特征結(jié)合16S rDNA基因的序列分析，確定黏細(xì)菌菌株的系統(tǒng)分類地位;利用基于黏細(xì)菌特異性引物的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析黏細(xì)菌的多樣性。結(jié)果顯示，從不同植被根際土壤中共分離得到19株，初步鑒定為黏球菌屬（Myxococcus）11株，珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株，孢囊桿菌屬（Cystobacter） 2株，多囊菌屬（Polyangium）1株，其中，紅樹林分離得到的黏細(xì)菌種類最多，共7株;樟木最少，為2株。PCR-DGGE分子指紋圖譜技術(shù)對其黏細(xì)菌多樣性結(jié)果顯示，花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林、樟木根際土壤中黏細(xì)菌的物種豐度分別為16、24、34、26、30、24，多樣性指數(shù)分別為2.10、2.53、3.49、2.62、2.77、2.73。DGGE指紋圖譜顯示，越南不同植被根際土壤存在大量的未培養(yǎng)黏細(xì)菌，其技術(shù)研究黏細(xì)菌多樣性比傳統(tǒng)分離純化的方法方便、快速。本研究為黏細(xì)菌開發(fā)利用和多樣性研究提供理論與技術(shù)參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：PCR-DGGE（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳）;根際土壤;黏細(xì)菌;多樣性

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0264-05

黏細(xì)菌是一類革蘭氏陰性細(xì)菌，具有復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生行為[1]，可形成多細(xì)胞的子實(shí)體結(jié)構(gòu)和抗逆的黏孢子。在系統(tǒng)進(jìn)化上，黏細(xì)菌位于變形菌門（Proteobacteria）的δ變形菌亞綱（Deltaproteobacteria）[2]，共分屬3個(gè)亞目、8個(gè)科、23個(gè)屬、50多個(gè)種[3-7]。黏細(xì)菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎、種類多、作用機(jī)制多樣的特性，目前被公認(rèn)為是僅次于放線菌之后的第二類藥源微生物的新類群[8-9]。

目前，對黏細(xì)菌的多樣性研究一直以來都是采用平板培養(yǎng)分離方法[10-15]，這種傳統(tǒng)分離方法不僅耗時(shí)耗力，而且不能很好地反映土壤黏細(xì)菌多樣性的初始狀態(tài)，因?yàn)橥寥乐性S多存活但不可培養(yǎng)的黏細(xì)菌不能被分離與鑒定。利用分子生物學(xué)方法可以克服傳統(tǒng)分離方法的缺陷[16]。目前尚未有不同植被根際土壤可培養(yǎng)與未培養(yǎng)黏細(xì)菌多樣性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究采用傳統(tǒng)的輔助菌誘導(dǎo)方法，對樣品的黏細(xì)菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)結(jié)合16S rDNA基因的序列分析，確定黏細(xì)菌的系統(tǒng)分類地位;利用基于黏細(xì)菌特異性引物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）[17]分析黏細(xì)菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 采集越南菊芳國家公園花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林和樟木的根際土壤，為防止霉菌的污染，立即自然室溫風(fēng)干，放入4 ℃冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要培養(yǎng)基[7] 水瓊脂培養(yǎng)基 （WCX） 、VY/2 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 取風(fēng)干的土樣2.5～3.0 g，用含100 μg/mL放線菌酮的無菌水浸泡過夜，6 000 r/min 離心5 min收集樣品。

1.2.2 黏細(xì)菌子實(shí)體的誘導(dǎo) 用E.coil、Achromobacter sp.2種被捕食菌菌漿在WCX培養(yǎng)基上劃十字交叉線，30 min后在十字線交叉點(diǎn)處接種大豆大小的經(jīng)放線菌酮處理的土樣，30 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d后觀察子實(shí)體的形成。

1.2.3 純化與保藏 挑取可疑菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)純，純化的菌株分別用VY/2斜面培養(yǎng)基、15%甘油及凍干管保藏。

1.2.4 土壤DNA的提取及擴(kuò)增 土壤DNA的提取使用Magen公司的土壤DNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增：mglA基因的半巢式PCR擴(kuò)增[18]，使用引物分別為mglA1F（5′-[JP9]CGCGAAATCAACTGCAAGAT-3′）與mglA5R（5′-[JP9]GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′）;及引物mglA4F（5′-[JP9]CAGGTGTTCTACGACGCCA-3′）與 mglA5R（5′-[JP9]GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′）[19]。PCR擴(kuò)增體系均為25 μL：10×PCR 緩沖液5.0 μL，10 μmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L mglA1F（或mglA4F）1 μL，10 μmol/L mglA5R 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 20 μL。第1輪PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min。第2輪PCR采用touch-down PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán);95 ℃ 變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，4 ℃保存待用。

1.2.5 DGGE分析

DGGE參考Muyzer等的方法[17]，所用的儀器為美國Bio-rad公司的DCodeTM Universal Mutation Detection System電泳系統(tǒng)。DGGE電泳所用的膠濃度為8% （丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺37.5 ∶1），變性劑為尿素和甲酰胺，其濃度梯度為40%～75%，電泳緩沖液為1×TAE，上樣緩沖液為溴酚藍(lán)，電泳電壓70 V，電流100 mA，電泳時(shí)間720 min。將第2次PCR產(chǎn)物濃縮至20 ?μL用于DGGE分析。電泳完成后，將DGGE產(chǎn)物于Goldview核酸染色劑染色0.5 h，凝膠成像儀中觀察結(jié)果并照相。利用Quantity One軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被根際土壤性質(zhì)

土壤微生物的量受植被類型的影響，不同的植被類型由于其地上部分生物量的差異，使得土壤中的有機(jī)碳量明顯不同，不同種類的植被，其枯落物的質(zhì)量也不盡相同，這2個(gè)因素均會(huì)影響土壤微生物的活動(dòng)[20]。由表1可見，土壤平均水溶性鹽含量為9.90 g/kg，其中鐵木的最低，為4.40 g/kg，樟木的最高，為15.50 g/kg。土壤平均有機(jī)質(zhì)含量較高，為58.54 g/kg，紅樹林最高，為106.64 g/kg，針葉林最低，為14.40 g/kg。pH 值為4.68～6.47，偏酸。

2.2 不同植被根際土壤可培養(yǎng)黏細(xì)菌的分類鑒定

黏細(xì)菌的形態(tài)特征主要包括營養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)、黏孢子形態(tài)以及它們特征性的菌落結(jié)構(gòu)。黏細(xì)菌的分類主要保持在形態(tài)上，且由于其形態(tài)的復(fù)雜性決定著形態(tài)分類比其他細(xì)菌更為可靠[1]。Sprer等曾證實(shí)了形態(tài)分類是與黏細(xì)菌在種水平上的分類相吻合的試驗(yàn)，并認(rèn)為形態(tài)分類對黏細(xì)菌新種鑒定仍是一種可靠的手段[21]。根據(jù)《Bergeys Manual of Determinative Bacteriology》 （第九版）[22]和《Prokayotes》（第二版）[23]的黏細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)，分離得到黏球菌屬（Myxococcus）11株、珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株、孢囊桿菌屬（Cystobacter）2株（未純化）、多囊菌屬（Polyangium）1株，其中，紅樹林分離得到的黏細(xì)菌種類最多，共7株，其次是鐵木和亞熱帶常綠闊葉林，均為6株，花梨木和針葉林均為3株，樟木最少，為2株（表2）。

橙色黏球菌（Myxococcus fulvus）的子實(shí)體橘黃色、球形且比較黏滑;黃色黏球菌（Myxococcus ?xanthus）的子實(shí)體黃色、球狀、表面光滑，黏液較多;弱小珊瑚球菌（Corallococcus exiguous）為白色，球形，在自然條件下的子實(shí)體較小;珊瑚狀珊瑚球菌（Corallococcus coralloides）的子實(shí)體形態(tài)多樣，波浪狀或珊瑚狀，黃色，較黏滑;孢囊桿菌屬（Cystobacter）的孢子囊無柄、單個(gè)或成群，圓形或盤卷， 褐色; 葉柄黏球菌（Myxococcus stipitatus）是帶柄的黏球菌，子實(shí)體黃色或粉色，表面光滑;多囊菌屬（Polyangium）子實(shí)體白色或粉色，圓形、刻蝕培養(yǎng)基（圖1）。

2.3 不同植被根際土壤可培養(yǎng)黏細(xì)菌的分子鑒定

黏細(xì)菌菌株結(jié)合16S rDNA 進(jìn)行序列分析，將其鑒定到屬。6種不同植被根際土壤可培養(yǎng)的黏細(xì)菌共分離得到19株，依據(jù)黏細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及16S rDNA 序列分析（圖2），利用5個(gè)不同種屬的黏細(xì)菌建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定黏細(xì)菌分屬于3個(gè)屬，Ⅰ類為黏球菌屬（Myxococcus），Ⅱ類為珊瑚球菌屬（Corallococcus），Ⅲ類為多囊桿菌屬（Polyangium）。

2.4 DGGE分析不同植被根際土壤黏細(xì)菌的多樣性

不同植被根際土壤黏細(xì)菌DGGE圖譜見圖3。由表3可知，花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林、樟木根際土壤中黏細(xì)菌的物種豐度（S）分別為16、24、34、26、30、24，多樣性指數(shù)（H ）分別為 2.10、2.53、3.49、2.62、2.77、2.73，與可培養(yǎng)黏細(xì)菌（表2）相比，土壤中存在大量的未培養(yǎng)黏細(xì)菌。而樣本間的相似性系數(shù)（表4）表明，花梨木與針葉林土壤樣品黏細(xì)菌相似性系數(shù)最低，為2.4%，鐵木與紅樹林土壤樣品黏細(xì)菌相似性系數(shù)最高，為47.4%，說明不同植被下黏細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中6種植被根際土壤性質(zhì)為含鹽量較低，有機(jī)質(zhì)含量較高，土質(zhì)偏酸性。黏細(xì)菌通常出現(xiàn)在中性至微堿性的土壤中，在pH值較低的環(huán)境中，可能因其營養(yǎng)缺乏，一般僅有黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）、 橙色黏球菌（Myxococcus fulvus）、變綠黏球菌（Myxococcus virescens）和珊瑚狀珊瑚球菌（Corallococcuscoralloides），偶爾出現(xiàn)多囊菌（Polyangiun） 和蝶形囊球菌（Angiococcus disciformis）。真正的嗜酸性黏細(xì)菌還有待繼續(xù)發(fā)現(xiàn)[24-25]。本研究的土壤pH值為 4.68～6.47，除了通?？梢苑蛛x得到的黏球菌屬和珊瑚球菌屬，還分離得到在酸性環(huán)境中少見的多囊菌屬與在酸性環(huán)境中未曾報(bào)道的孢囊桿菌屬，這與黏細(xì)菌子實(shí)體和黏孢子具有很強(qiáng)的抗逆性，以及越南特殊的土壤微環(huán)境有關(guān)，使較多種類的黏細(xì)菌更適合生存;同時(shí)也進(jìn)一步說明，在酸性環(huán)境條件下，不同植被的根際土壤，能為黏細(xì)菌提供不同的食物基礎(chǔ)和生存生境，黏細(xì)菌的多樣性也存在差異，6個(gè)樣品中，樟木根際土壤只分離到2株珊瑚狀珊瑚球菌，得到的可培養(yǎng)黏細(xì)菌最少;其次是花梨木，分離得到2株橙色黏球菌和1株珊瑚狀珊瑚球菌，針葉林分離到2株橙色黏球菌和1株弱小珊瑚球菌;鐵木和亞熱帶常綠闊葉林較多，均為6株，鐵木分別為黃色黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和孢囊桿菌，亞熱帶常綠闊葉林為黃色黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和多囊菌;紅樹林分離得到的最多，包括橙色黏球菌、黃色黏球菌、葉柄黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和孢囊桿菌，共7株。

為了有效避免在傳統(tǒng)分離純化過程中造成的黏細(xì)菌遺傳多樣性信息的丟失，使得分析結(jié)果更真實(shí)、全面地反映黏細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，利用DGGE圖譜進(jìn)一步分析6種不同植被根際土壤的黏細(xì)菌多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中可能存在大量的難培養(yǎng)黏細(xì)菌或未培養(yǎng)黏細(xì)菌的資源，在分離純化過程中，黏細(xì)菌純化過程相對較長且不易純化，可能與土壤中黏細(xì)菌的伴生菌難以分離有關(guān)，其原因須進(jìn)一步研究。另一原因，可能由于越南地處北回歸線以南，雨量充沛，年平均降水量1 500～2 000 mm，是典型的熱帶地區(qū)，霉菌污染相對較多。由于其特殊的地理環(huán)境，需對越南黏細(xì)菌挖掘篩選方法進(jìn)一步改善，以期獲得更多的黏細(xì)菌類群，豐富黏細(xì)菌資源。不同植被覆蓋的根際土壤黏細(xì)菌資源不同，且有明顯差異，說明不同植被覆蓋的根際土壤微生境不同，從而決定其群落結(jié)構(gòu)的差異，不同的群落結(jié)構(gòu)可能存在不同的黏細(xì)菌類群。

到目前為止，熱帶亞熱帶根際土壤黏細(xì)菌分離純化這一特殊生境中黏細(xì)菌資源的研究尚處于啟蒙階段，特別是在酸性環(huán)境條件下的黏細(xì)菌研究，還須繼續(xù)探索分離純化方法。黏細(xì)菌是一類天然藥物篩選資源，在其活性篩選、代謝產(chǎn)物等方面，有待進(jìn)一步研究。

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