李文妹 尤青海 常遠(yuǎn)敏

2018年最新的全球腫瘤統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示肺癌是全球發(fā)病率、致死率最高的癌癥：無(wú)論是發(fā)病率(11.6%)還是死亡率(18.4%)均名列第一。雖然隨著生物免疫制劑及分子靶向治療的廣泛應(yīng)用，肺癌仍是一種預(yù)后極差的疾病，即便采用綜合治療，總體生存率仍未改變[1]。診斷與預(yù)后評(píng)估對(duì)于肺癌患者至關(guān)重要，在臨床工作中診斷及預(yù)后評(píng)估是重點(diǎn)。肺癌引起的惡性胸腔積液是腫瘤晚期常見的并發(fā)癥，約15%非小細(xì)胞肺癌伴有惡性胸腔積液，50%非小細(xì)胞肺癌最終轉(zhuǎn)移至胸膜，發(fā)展為惡性胸腔積液[2-3]。惡性胸腔積液臨床預(yù)后差，中位生存期僅為3～12個(gè)月[1]。雖然細(xì)胞學(xué)、胸腔鏡等檢查可以作為惡性胸腔積液的有效檢測(cè)指標(biāo)，但由于各自缺點(diǎn)，使得臨床應(yīng)用受限，而且胸腔積液細(xì)胞學(xué)的診斷率為50～70%[4]。因此，尋找靈敏度和特異性高的診斷方法對(duì)提高良惡性胸腔積液診斷率十分重要。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在試圖尋找更有效的檢測(cè)指標(biāo)以提高惡性胸腔積液的檢出率，腫瘤標(biāo)志物就是其中的研究熱點(diǎn)。Crk樣蛋白(CRKL)是Crk(CT10激酶的調(diào)節(jié)因子)家族成員之一，在胃癌、肺癌等實(shí)體腫瘤中表達(dá)增加[5-6]，但目前未見胸腔積液中CRKL表達(dá)的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)胸腔積液中CRKL含量，評(píng)估其臨床意義。

資料與方法

一、臨床資料

收集2017年10月至 2019年3月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的胸腔積液患者93例。其中實(shí)驗(yàn)組47例，包括腺癌38例，鱗癌6例，小細(xì)胞肺癌3例；其中男/女，35/12，年齡在39～85歲，平均年齡(64.55 ± 11.17)歲。對(duì)照組46例，包括肺部感染35例，結(jié)核5例，其他6例，男/女，28/18，年齡26～83歲，平均年齡(62.59 ± 14.55)歲。

二、研究方法

1 主要試劑 CRKL、CEA ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)云克隆公司(CCC，USA)。

2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 無(wú)菌采集兩組患者清晨空腹靜脈血3 mL，室溫靜止2 h后，1000 r·min-1，離心15 min。收集上層血清分裝，- 80℃保存。留取胸腔積液10 mL，同血液血清離心分裝保存。ELISA如下：①準(zhǔn)備: 試劑盒室溫復(fù)溫30 min；②配液:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋成為原倍洗滌液；③加樣: 分別設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及待檢樣品孔，空白對(duì)照孔不加樣品；④溫育: 37℃ 溫育 30 min；⑤洗板；⑥加入酶標(biāo)工作液；⑦溫育:37℃ 溫育30 min；⑧洗板；⑨顯色；⑩終止: 每孔加入500μL 終止液，可見顏色由藍(lán)立即轉(zhuǎn)為黃色。以空白孔為調(diào)零孔，終止反應(yīng)15 min內(nèi)，于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值?！?1計(jì)算: 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，根據(jù) OD 值計(jì)算樣本濃度。

3 數(shù)據(jù)處理 各組臨床資料比較采用SPSS 25.0軟件，不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，通過Mann-Whitney U-test確定兩個(gè)獨(dú)立組之間的差異。以惡性胸腔積液患者和良性胸腔積液患者的CRKL、CEA水平作為對(duì)照，構(gòu)建受試者操作特征(ROC)曲線。選擇的截止值是那些具有最高準(zhǔn)確性的值，分別計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，使用邏輯回歸模型評(píng)估這兩種聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物在鑒別良惡性胸腔積液中的效用。

結(jié) 果

一、 兩組患者血清及胸腔積液中CRKL及CEA比較 兩組在性別、年齡等一般資料統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)(見表1a、b)；觀察組胸腔積液中的血清及胸腔積液中的CRKL、CEA高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)(見表2)。

表1a 兩組胸腔積液患者性別比較

表1b 兩組胸腔積液患者年齡比較

表2 兩組患者血清和胸腔積液CRKL和CEA含量M(P25,P75)

二、 血清及胸腔積液中CRKL、CEA的診斷臨界點(diǎn)及其診斷效能

血清及胸腔積液中CRKL最佳臨界值分別為 2.04 ng/mL、3.04 ng/mL，靈敏度分別為80.9%、74.5%，特異性分別為80.4%、84.8%；血清及胸腔積液中CEA最佳臨界值分別為8.4 ng/mL、15.29 ng/mL，靈敏度分別為66%、74.5%，特異性分別為91.3%、97.8%。聯(lián)合檢測(cè)血清及胸腔積液中CRKL的靈敏度為80.9%，特異性為80.4%；聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液CRKL與CEA的靈敏度為89.4%，特異性為95.7%；聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液及血清CEA的靈敏度為74.5%，特異性為95.7%；四者聯(lián)合的靈敏度為87.2%，特異性為97.8%(見圖1、表3)。

討 論

CRKL作為一種癌基因，位于22q11.21擴(kuò)增區(qū)域的中間，并且被確定為許多癌癥中最常被擴(kuò)增的區(qū)域之一，在多種癌癥進(jìn)展中有著重要作用，包括胰腺癌的細(xì)胞增殖和侵襲，肺癌的細(xì)胞侵襲和肝癌的增殖、遷移和侵襲[7-9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)CRKL可能為一些腫瘤的治療靶點(diǎn)，如卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌等[6,10-13]。CRKL與肺癌的關(guān)系是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，CRKL可能通過促進(jìn)cyclin D1和cyclin B1介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，CRKL在NSCLC中的過表達(dá)與腫瘤分化、組織學(xué)類型、p-TNM分期、腫瘤細(xì)胞增殖、患者生存質(zhì)量差有直接關(guān)系，鑒于這些發(fā)現(xiàn)認(rèn)為CRKL可能是肺癌治療的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)[6]。研究證實(shí)CRKL與NSCLC中EML4-ALK突變致癌有關(guān)；CRKL的下調(diào)可阻斷RAS和RAC1等ALK下游通路的激活，導(dǎo)致這些細(xì)胞的存活、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)化活性降低，提出間接抑制CRKL的活化可能是提高ALK-重排NSCLC患者ALK抑制劑療效的有效策略[14]。另外發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清CRKL水平顯著高于健康者，在晚期乳腺癌患者中，血清可溶CRKL較早期患者高[15]，從而推測(cè)CRKL可作為肺癌患者的腫瘤標(biāo)志物。

圖1 血清及胸腔積液中CRKL、CEA對(duì)惡性胸腔積液診斷價(jià)值的ROC曲線

表3 血清及胸腔積液中CRKL、CEA診斷診斷效能

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清及胸腔積液中CRKL中位數(shù)分別為3.02 ng/mL、3.87ng/m，這與以往研究肺癌組織中CRKL較肺正常組織表達(dá)高相一致[6,8]。單獨(dú)檢測(cè)血清及胸腔積液中CRKL靈敏度分別為80.9%、74.5%，特異性分別為80.4%，84.8%。本研究表明血清CRKL靈敏度高于胸腔積液CRKL的靈敏度，胸腔積液CRKL特異性高于血清中CRKL的特異性，聯(lián)合檢測(cè)血清、胸腔積液CRKL靈敏度及特異性較單獨(dú)檢測(cè)胸腔積液CRKL的靈敏度增加。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清及胸腔積液中CEA中位數(shù)分別為8.4 ng/mL、15.29 ng/mL，靈敏度分別為66%、74.5%，特異性分別為91.3%、97.8%，聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液及血清CEA的靈敏度為74.5%，特異性為95.7%，這與以往研究結(jié)果一致[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示單獨(dú)檢測(cè)CRKL水平靈敏度高于單獨(dú)檢測(cè)CEA的靈敏度，但特異性較單獨(dú)檢測(cè)CEA低。聯(lián)合檢測(cè)CRKL與CEA可明顯提高靈敏度，四者聯(lián)合檢測(cè)靈敏度可達(dá)87.2%，明顯高于單獨(dú)檢測(cè)CEA靈敏度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在晚期肺惡性腫瘤患者的血清及胸腔積液中CRKL含量升高，CRKL可作為鑒定良惡性胸腔積液的重要輔助指標(biāo)；胸腔積液CRKL聯(lián)合胸腔積液CEA檢測(cè)，可提高惡性胸腔積液的診斷價(jià)值。這些數(shù)據(jù)應(yīng)該在未來(lái)的臨床試驗(yàn)中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。