馮群，高嘉敏，夏嬙

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，廣東 珠海519041)

腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的主要原因，預(yù)計(jì)到2035 年每年新增腫瘤病例2 400 萬，死亡人數(shù)將突破1 300 萬［1］。腫瘤的傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)和放化療為主，不良反應(yīng)大，且存在復(fù)發(fā)、多藥耐藥以及機(jī)體免疫力低下的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步增加了腫瘤治療的難度。其中腫瘤普遍存在的多藥耐藥及如何提高藥物靶向性一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，對(duì)此學(xué)者們將腫瘤藥物的研發(fā)轉(zhuǎn)向天然生物產(chǎn)物，期望能夠找到一種新的、高效無毒的抗腫瘤藥物替代或部分替代常規(guī)化療藥物［2］。天然多肽分子抗菌肽除具備抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合以及中和體內(nèi)毒素等活性外，還具有抗腫瘤活性，如LL-37 是唯一一個(gè)來自人類的免疫防御肽，其可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［3］;SALF、Pardaxin 和HPRP-A1抗菌肽能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡［4-6］;抗菌肽17BIPHE2 可顯著抑制肺腺癌A549 細(xì)胞增殖［7］;蜘蛛來源肽Gomesin 可抑制小鼠黑色素瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，且對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響［8-9］。以上研究均表明抗菌肽具有抗癌活性。

黑水虻black soldier fly，Hermetia illucens L.(Diptera:Stratiomyidae)，學(xué)名亮斑扁角水虻，是一種與蠅蛆、黃粉蟲等齊名的雙翅目水虻科的重要資源昆蟲，全球分布廣泛［10］，長期暴露的生存環(huán)境使其形成了強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)。對(duì)黑水虻來源抗菌肽的研究始于2013 年［11］，目前黑水虻抗菌肽已在大腸埃希菌和畢赤酵母X-33 中成功表達(dá)，并表現(xiàn)出對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌良好的抑菌活性［12-13］，與其 他 昆 蟲 來 源 肽 如 天 蠶 素［14］、Bmattacin 2［15］、cecropins［16］、ABP-dHC-A-K［17］、黃粉蟲防御素［18］以及蜂毒素［19］等的作用一致，表明黑水虻抗菌肽在未來醫(yī)藥研發(fā)方面具備巨大潛能。然而，黑水虻抗菌肽抑癌活性的研究鮮見報(bào)道，本研究以黑水虻幼蟲抗菌肽為研究對(duì)象，探討其抗癌及溶血效應(yīng)，旨在為未來抗腫瘤藥物的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 黑水虻蟲卵來自珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;雄性豚鼠，4 只，2 ～3 月齡、體重300 ～350 g，合格證號(hào):SCXK(京)2016-0002，由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.1.2 細(xì)胞株 結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT-8)、肺腺癌細(xì)胞株(A549)、宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)以及正常人胚腎細(xì)胞株(HEK293)標(biāo)準(zhǔn)株購于中國科學(xué)院上海ATCC 細(xì)胞庫。

1.1.3 主要試劑 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)購于美國Sigma 公司;RPMI-1640、DMEM(Dulbecco's modification of Eagle' s medium Dulbecco)、MEM(Minimum Essential Medium)、McCoy's 5A (McCoy's 5a medium)培養(yǎng)基以及氨芐青霉素、鏈霉素產(chǎn)品購于澳大利亞Gibco 公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK(cell counting kit)-8試劑盒購自日本同仁公司，批號(hào):LF673。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(3K15，美國Thermo fisher 公司);精密電子天平(BSA-124S 型，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(IX71，日本OLYMPUS 公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90，中國Heal Force 公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Elx-800 型，德國萊卡公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽粗提物的誘導(dǎo)提取 抗菌肽的誘導(dǎo)提取參照夏嬙等［11］的提取方法，用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)黑水虻5 齡幼蟲，常規(guī)飼養(yǎng)24 h 后采用斷頭取血法收集幼蟲血淋巴。將收集的血淋巴于4 ℃、13 225 ×g 離心15 min，輕輕吸取上清后轉(zhuǎn)移至50 mL 超濾管中(規(guī)格:10 kD)，4 ℃、5 000 ×g 離心35 min，然后轉(zhuǎn)移濾液至3 kD 的超濾管中，4 ℃、5 000 ×g 離心20 min，截留部分即抗菌肽粗提液。透析24 h 除去部分鹽和色素，于-80 ℃冰箱過夜，真空冷凍干燥，收集抗菌肽粗提物粉末于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞的體外生長曲線 ①取對(duì)數(shù)期HCT-8、A549、HeLa、SKOV3 和HEK293 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640(HCT-8 和A549)、MEM(HeLa)、McCoy's 5A(SKOV3)和DMEM(HEK293)培養(yǎng)基中，待細(xì)胞貼壁達(dá)80%時(shí)棄除培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，用0.9%氯化鈉注射液制成細(xì)胞懸液，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7 ×104個(gè)/mL，以100 μL/孔的量將細(xì)胞懸液鋪于96 孔板中，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組4 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。②每日取出需要檢測(cè)的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8，再放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長490 nm處的吸光度值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，繪制每株細(xì)胞的生長曲線。

1.2.3 敏感腫瘤細(xì)胞株篩選 ①細(xì)胞鋪板步驟同

1.2.2。②培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，吸出原培養(yǎng)基，分別向每株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組添加100 μL 濃度為12. 5、25、50、100、200 和400 mg/L 的黑水虻抗菌肽粗提物溶液(常規(guī)培養(yǎng)基配制)，陰性對(duì)照組則加入100 μL常規(guī)培養(yǎng)基，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。③作用24 h 后，向每孔細(xì)胞加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，之后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為490 nm 處的吸光度值。計(jì)算出每株細(xì)胞的抑制率，具體公式:抑制率(%)=A(陰性對(duì)照組)- A(實(shí)驗(yàn)組)/A(陰性對(duì)照)×100%。比較4 株腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，篩選出對(duì)黑水虻抗菌肽粗提物較敏感的腫瘤細(xì)胞株。④篩選出敏感腫瘤細(xì)胞株后，在相同條件下與陽性對(duì)照藥物5-FU 比較。

1.2.4 黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)正常細(xì)胞影響 檢測(cè)抗菌肽粗提物對(duì)正常細(xì)胞HEK293 的毒性作用，細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板及抗菌肽粗提物濃度設(shè)置步驟同1.2.3。

1.2.5 黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)紅細(xì)胞溶血的影響

①采用心臟采血法采集健康豚鼠血液2 mL，離心收集血細(xì)胞，輕輕吸出紅細(xì)胞層至另外一支潔凈試管，磷酸鹽緩沖液洗滌4 次，用0.9%氯化鈉注射液配成2%的紅細(xì)胞懸液。②用0.9%氯化鈉注射液配制濃度為1 000 mg/L 抗菌肽粗提物，再用0.9%氯化鈉注射液對(duì)粗提物溶液進(jìn)行倍比稀釋，實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為62.5、125、250、500、1 000 mg/L。③取出一塊96 孔板，所需孔先加入50 μL 2%的紅細(xì)胞懸液，向?qū)嶒?yàn)組加入50 μL 不同濃度的抗菌肽粗提物，使實(shí)驗(yàn)組抗菌肽粗提物的終濃度為31.25、62.5、125、250、500 mg/L，陰性對(duì)照組加入等量0.9%氯化鈉注射液，陽性對(duì)照組加入等量純水，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。④加完樣，輕輕晃動(dòng)96 孔板使細(xì)胞均勻分布，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出后1 000 ×g 離心5 min，然后吸出60 μL 上清至新的96 孔板中，利用酶標(biāo)儀測(cè)定414 nm 處的吸光度A 值。溶血率(%)=〔A(實(shí)驗(yàn)孔)-A(陰性孔)〕/〔A(陽性孔)-A(陰性孔)〕×100%。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 繪制4 種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的生長曲線;比較黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)4 種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的抑制情況;在抑制率最高的濃度下，對(duì)各組細(xì)胞的抑制情況;比較黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制作用;觀察黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4 株癌細(xì)胞和1 株正常細(xì)胞的生長曲線 4 株癌細(xì)胞(A549、HeLa、SKOV3、HCT-8)和1 株正常細(xì)胞(HEK293)均在培養(yǎng)1 d 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，3 d達(dá)到峰值，之后逐漸下降。故選取培養(yǎng)1 d 的細(xì)胞進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 5 株細(xì)胞的生長曲線

2.2 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)5 種細(xì)胞的增殖抑制率 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 4 種細(xì)胞均有一定的抑制作用(P ＜0.05)，且隨著濃度的增加，抑制率逐漸升高，其中400 mg/L 濃度下的黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率最大。不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)HEK293 無抑制作用(P ＞0. 05)。在400 mg/L 濃度下，黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 以及HEK293 5 種細(xì)胞的抑制率不同(F=54.495，P ＜0.001)，其中對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制率最高，對(duì)HEK293 的抑制率最低。見表1。

表1 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h對(duì)5 種細(xì)胞的增殖抑制率 (%，±s)

表1 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h對(duì)5 種細(xì)胞的增殖抑制率 (%，±s)

a 與12.5 mg/L 組比較，P ＜0.05

HCT-8 A549 SKVO3 HeLa HEK293 12.5 mg/L 組 5.68±1.21 7.71±1.66 8.25±2.05 8.67±0.55 1.67±2.65 25 mg/L 組 6.09±1.77a 8.14±1.74a 13.50±1.58a 10.64±0.33a 3.33±2.23 50 mg/L 組 8.07±1.02a 8.18±1.21a 10.95±0.91a 12.26±0.31a 3.35±2.62 100 mg/L 組 15.48±1.44a 8.54±0.75a 18.28±2.85a 12.17±0.52a 5.33±3.93 200 mg/L 組 25.81±2.04a 8.55±0.94a 18.69±1.69a 13.84±0.61a 8.18±2.89 400 mg/L 組 41.76±7.34a 10.72±0.87a 21.06±0.82a 20.81±0.21a 9.93±2.07 F 值組別196.596 6.191 62.680 11.066 2.442 P 值＜0.001 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.074

2.3 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制作用比較 黑水虻抗菌肽粗提物在12.5、25、50、100 mg/L 時(shí)對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制率與50 mg/L 的5-FU 對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且粗提物的作用較5-FU 弱。當(dāng)黑水虻抗菌肽粗提物濃度為200 mg/L 時(shí)，與5-FU 處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。黑水虻抗菌肽粗提物濃度為400 mg/L 時(shí)，對(duì)HCT-8 細(xì)胞的抑制率較5-FU 處理組高(P ＜0.05)。見表2。

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對(duì)HCT-8細(xì)胞的體外增殖作用比較 (%，±s)

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對(duì)HCT-8細(xì)胞的體外增殖作用比較 (%，±s)

5-FU:5-氟尿嘧啶;a 與5-FU 處理組比較，P ＜0.05

組別 抑制率50 mg/L 5-FU 組 24.58 ±0.88 12.5 mg/L 組 5.57 ±0.85a 25 mg/L 組 6.09 ±2.50a 50 mg/L 組 8.07 ±1.20a 100 mg/L 組 15.38 ±1.18a 200 mg/L 組 25.82 ±2.26 400 mg/L 組 41.77 ±2.13a F 值176.396 P 值＜0.001

2.4 黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用抗菌肽粗提物的濃度為0、31. 25、62. 5、125、250、500 mg/L 時(shí)的溶血率分別為0、(0.16 ±0.11)%、(0. 20 ± 0. 12)%、(0. 95 ± 0. 04)%、(1. 09 ±0.16)%、(1.60 ±0.18)%、組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.778，P=0.210)，且溶血率均低于5%。

3 討 論

CCK-8 是一種細(xì)胞活性檢測(cè)劑，目前已被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域，如新藥篩選、細(xì)胞毒性鑒定及腫瘤放射敏感性觀察等，該檢測(cè)方法在操作上具有簡單、快速、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)。本課題組采用CCK-8探討黑水虻幼蟲抗菌肽粗提物對(duì)HCT-8、A549、SKOV3和HeLa 4 種癌細(xì)胞株的增殖抑制情況發(fā)現(xiàn)，抗菌肽粗提物對(duì)4 株癌細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，尤其是對(duì)HCT-8 的作用較明顯，隨著濃度的升高抑制率也升高。與HCT-8 細(xì)胞株的陽性藥物5-FU 比較發(fā)現(xiàn)，低濃度抗菌肽粗提物的作用較5-FU的作用弱，當(dāng)濃度達(dá)到400 mg/L 時(shí)，效果則優(yōu)于5-FU，表明高濃度黑水虻抗菌肽粗提物有望代替或者部分代替5-FU 用于未來結(jié)腸癌的治療。本研究以正常HEK293 細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞，探究抗菌肽在作用于癌細(xì)胞的同時(shí)是否也作用于正常細(xì)胞，以保障實(shí)驗(yàn)的完整性。結(jié)果顯示，黑水虻抗菌肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，表明黑水虻抗菌肽粗提物的抗癌作用具有選擇性。關(guān)于作用機(jī)制有研究認(rèn)為，抗菌肽可作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜，影響DNA 復(fù)制;或通過產(chǎn)生大量活性氧類、增加Ca2+內(nèi)流等激活信號(hào)通路;也可通過激活和聚集樹突狀細(xì)胞，從而提高機(jī)體免疫力［20］。此外，抗菌肽還可作為一種免疫佐劑，通過增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用［21］。但不同來源的抗菌肽的作用機(jī)制存在差異。因此，黑水虻來源肽的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

溶血即紅細(xì)胞被破壞后，血紅蛋白被釋放出來的現(xiàn)象，說明某物質(zhì)具有破壞紅細(xì)胞胞膜的作用，間接反映該物質(zhì)的安全性。近年來，一些抗菌肽如Cecropin A 和B、Magainin、melittin、Tachyplesin I、cathelicidin 家族PR-39、Mastoparan 及人工合成的抗菌肽CM-S 被認(rèn)為是理想的抗腫瘤藥物［22-24］，但因其在體內(nèi)具有溶血作用而導(dǎo)致應(yīng)用受限。因而需要對(duì)已有抗菌肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或者尋找新的抗菌肽來源，盧亞麗等［25］報(bào)道，動(dòng)物內(nèi)源性抗菌肽CGA-N46、JH-3 不具有溶血作用。Kim 等［26］報(bào)道，Harmoniasin類似物HaA4 可在不溶血的情況下作用于白血病細(xì)胞U937 和Jurkat 細(xì)胞。Sang 等［17］研究報(bào)道，天蠶素類似物ABP-dHC-Cecropin A 對(duì)K562、U937 和THP-1等白血病細(xì)胞具有濃度依賴性細(xì)胞毒性，其在最高檢測(cè)濃度(800 μmol/L)時(shí)也未顯示出明顯的溶血活性。夏一赫等［27］發(fā)現(xiàn)，抗菌肽JH-3 的溶血率低于5%。本研究測(cè)定了黑水虻抗菌肽粗提物對(duì)紅細(xì)胞的溶血性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑水虻抗菌肽粗提物的濃度不大于500 mg/L 時(shí)對(duì)紅細(xì)胞也無溶血活性，表明黑水虻抗菌肽有較好的安全性。

目前，在已發(fā)現(xiàn)的具有抗癌活性的200 種抗微生物肽中，有些抗菌肽已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段［28］，且尚未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)抗菌肽有耐藥現(xiàn)象，甚至有抗菌肽具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［29］，顯示抗菌肽在抗癌藥物研發(fā)方面的巨大潛力。本研究表明，黑水虻抗菌肽對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性作用，對(duì)正常細(xì)胞無毒、對(duì)紅細(xì)胞不溶血，是未來腫瘤藥物研發(fā)得較好來源之一。