李曉蕓 倪茜茜 華 靜

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近年研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑具有抗炎、抗氧化活性。目的：探討PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和GW1929對體內(nèi)外高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法：C57BL/6J小鼠喂飼高脂飲食并予羅格列酮灌胃干預(yù)(30 mg/kg,每日一次，連續(xù)4周)；分離小鼠原代肝細(xì)胞，以GW1929預(yù)處理后予混合游離脂肪酸(FFA)孵育。以HE染色和油紅染色評估肝臟組織病理學(xué)改變和脂質(zhì)沉積；測定血清丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；DCFH-DA熒光探針檢測肝細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量；Real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：高脂飲食小鼠肝臟顯著脂肪變性，肝內(nèi)炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，血清MDA含量升高，SOD活性和GSH含量降低。羅格列酮干預(yù)可顯著減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積，下調(diào)炎癥相關(guān)基因表達(dá)，改善血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。FFA孵育的原代肝細(xì)胞內(nèi)ROS大量生成，GW1929預(yù)處理可顯著減少FFA誘導(dǎo)的ROS生成和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，并上調(diào)抗氧化因子核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)及其下游靶基因血紅素氧合酶-1(HO-1)表達(dá)。結(jié)論：體內(nèi)外高脂環(huán)境均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，發(fā)生顯著的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。PPARγ激動(dòng)劑可通過減少ROS產(chǎn)生、激活Nrf2/HO-1抗氧化通路改善高脂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種除外乙醇和其他明確致病因素、以肝細(xì)胞異常脂肪蓄積為主要特征的臨床病理綜合征，其發(fā)生與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)[1]。目前被廣泛認(rèn)可的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為，肝臟脂質(zhì)沉積觸發(fā)一系列氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是促進(jìn)NAFLD發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素[2]。因此，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)已成為治療和改善NAFLD的重要途徑。近年研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)在改善胰島素抵抗、平衡脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。PPARγ激動(dòng)劑可改善NAFLD小鼠的胰島素抵抗和肝臟損傷，但其對抗高脂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制尚不清楚。本研究分別應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)和GW1929，對高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠和脂肪變性肝細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，旨在探討PPARγ激動(dòng)劑對體內(nèi)外高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并探討其可能作用機(jī)制，為NAFLD的臨床治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性SPF級(jí)8周齡C57BL/6J小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；高脂飼料(40%脂肪，40%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)；Research Diets)。棕櫚酸(palmitic acid, PA)、油酸(oleic acid, OA)、羅格列酮、GW1929、Ⅰ型和Ⅳ型膠原酶、臺(tái)盼藍(lán)染料(Sigma-Aldrich, Merck KGaA)；D-Hanks液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco, Thermo Fisher Scientific)；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(上海創(chuàng)賽科技有限公司)；油紅O染色液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙二醛(malon-dialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species, ROS)熒光探針(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；各兔抗鼠單克隆抗體(Abcam plc.; Cell Signaling Technology, Inc.)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模[3]：30 只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常飲食組(normal control, NC組)、高脂飲食組(high-fat diet, HF組)和羅格列酮干預(yù)組(high-fat diet + rosiglitazone, HF+RSG組)，每組各10只。NC組予普通飲食 16周；HF組予高脂飲食 16 周；HF+RSG組予高脂飲食12周后，在高脂飲食的同時(shí)予羅格列酮灌胃4周(30 mg/kg，每日一次)。造模結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟組織和眼球血用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 肝臟組織病理學(xué)檢查和油紅染色：肝臟組織標(biāo)本4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。另使用最佳切削溫度包埋劑進(jìn)行包埋，制備冰凍組織切片，油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脂質(zhì)沉積情況。

3. 血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測：眼球血標(biāo)本4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血清備用。參照試劑盒說明書，分別采用TBA比色法、羥胺法和微板法檢測MDA含量、SOD活性和GSH含量。

4. 小鼠原代肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)：8周齡正常飲食C57BL/6J小鼠以4%水合氯醛麻醉后打開胸腹腔，24 G穿刺針穿刺插管下腔靜脈，灌注D-Hanks液，至肝臟呈土黃色后繼以灌注含0.025%Ⅰ型膠原酶和 0.05% Ⅳ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基，至肝組織變軟后取下、剪碎，置于含膠原酶溶液中37 ℃水浴消化，100 μm無菌篩網(wǎng)過濾，獲得細(xì)胞懸液，離心獲得肝細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力>85%，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，接種于鋪有鼠尾膠原蛋白Ⅰ型的培養(yǎng)皿中，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)6 h，洗去未貼壁細(xì)胞。

5. 原代肝細(xì)胞的干預(yù)處理：按PA與OA 1∶2(PA: 0.33 mmol/L, OA: 0.66 mmol/L)的比例配制終濃度為1 mmol/L的混合游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)[4]。原代肝細(xì)胞培養(yǎng)6 h后換液，設(shè)立正常對照組(NC組)、脂肪酸孵育組(FFA組)和預(yù)先以GW1929(20 μmol/L)處理3 h后再加入含F(xiàn)FA培養(yǎng)基的干預(yù)處理組(GW1929+FFA組)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h或24 h，洗去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞待測。

6. 肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測：各組肝細(xì)胞孵育24 h后，加入DCFH-DA熒光探針(10 μmol/L)，避光孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。收集各組細(xì)胞，200 μL PBS重懸，接種于96孔板，以熒光酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長528 nm處熒光強(qiáng)度。

7. 氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因表達(dá)檢測：取少量凍存肝組織，研磨后提取總RNA；同時(shí)收集各組孵育6 h后的肝細(xì)胞提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增，檢測氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。目的基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

8. 蛋白質(zhì)印跡法：收集各組孵育24 h的肝細(xì)胞，以細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白。取蛋白樣品行 SDS-PAGE電泳，濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗鼠Keap1抗體(1∶1 000)、Nrf2抗體(1∶1 000)、HO-1抗體(1∶1 000)、GAPDH 抗體(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP耦聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫孵育l h；洗膜，ECL顯色，暗盒X線曝光，常規(guī)顯影、定影，應(yīng)用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PPARγ激動(dòng)劑對高脂飲食小鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)的影響

HF組小鼠經(jīng)高脂飲食喂飼16周后，肝臟組織可見大量空泡樣脂肪變性，油紅染色顯示大量脂質(zhì)沉積；經(jīng)羅格列酮干預(yù)4周的HF+RSG組小鼠肝臟組織脂肪變性明顯減輕，油紅染色顯示中等量脂質(zhì)沉積(圖1A)。高脂飲食可上調(diào)肝臟組織炎癥相關(guān)基因IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，羅格列酮干預(yù)則可下調(diào)上述基因mRNA表達(dá)(P<0.05,P<0.05,P<0.01；圖1B)。

二、PPARγ激動(dòng)劑對高脂飲食小鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與NC組小鼠相比，HF組小鼠血清MDA含量明顯升高，SOD活性和GSH含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05,P<0.01)；羅格列酮干預(yù)能明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，與HF組相比，HF+RSG組MDA含量降低，SOD活性和GSH含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,P<0.01；圖2)。

三、PPARγ激動(dòng)劑對脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

DCFH-DA ROS熒光探針檢測顯示，F(xiàn)FA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)ROS大量生成，F(xiàn)FA組與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GW1929預(yù)處理可顯著減少FFA誘導(dǎo)的ROS生成，GW1929+FFA組與FFA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖3)。

四、PPARγ激動(dòng)劑對脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測顯示，與NC組相比，F(xiàn)FA組肝細(xì)胞Keap1、IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)明顯升高，Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01)；GW1929預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，與FFA組相比，GW1929+FFA組Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，Keap1和各炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05；圖4)。

五、PPARγ激動(dòng)劑對脂肪變性肝細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，與NC組相比，F(xiàn)FA組肝細(xì)胞Keap1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)略有降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,P>0.05)；GW1929預(yù)處理可活化Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路，與FFA組相比，GW1929+FFA組Keap1蛋白表達(dá)降低，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.05,P<0.05；圖5)。

討 論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前最廣為接受的是“二次打擊”學(xué)說[2]。該學(xué)說中，“初次打擊”是指以胰島素抵抗為核心的肝臟糖脂代謝紊亂所致的肝內(nèi)脂肪異常蓄積，“二次打擊”則是在肝臟脂肪變性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步產(chǎn)生的各種炎性因子相互作用，線粒體氧化應(yīng)激功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化。氧化應(yīng)激在NAFLD的致病和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生與抗氧化防御能力失衡時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和損傷。肝細(xì)胞脂質(zhì)過載時(shí)，線粒體β-氧化活性增加，導(dǎo)致ROS生成增多，ROS堆積可直接造成肝細(xì)胞損傷，也可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起脂質(zhì)過氧化和慢性炎癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體內(nèi)高脂環(huán)境下，NAFLD模型小鼠血清氧化損傷產(chǎn)物MDA含量升高，抗氧化指標(biāo)SOD活性和GSH含量降低，提示體內(nèi)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Gómez-Lechón等[4]的研究表明，以1 mmol/L濃度的混合FFA(PA∶OA=1∶2)孵育肝細(xì)胞24 h是建立體外肝細(xì)胞脂肪變性模型的最適條件，適用于探討單純脂肪蓄積對肝臟的影響。因此，本研究以同樣配比和濃度的混合FFA孵育小鼠原代肝細(xì)胞，成功建立脂肪變性肝細(xì)胞模型。脂肪變性肝細(xì)胞處于氧化應(yīng)激晚期，細(xì)胞代謝失代償，ROS大量生成，促使胞質(zhì)中的抗氧化因子Nrf2與Keap1解離，Keap1表達(dá)顯著升高，Nrf2及其下游靶基因HO-1則因早期參與抗氧化而大量耗損，表達(dá)顯著降低，提示體外高脂環(huán)境同樣可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

**與NC組比較，P<0.01；兩組間比較，a P<0.05，b P<0.01

與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01；兩組間比較，a P<0.05，b P<0.01

綠色熒光代表肝細(xì)胞內(nèi)ROS

**與NC組比較，P<0.01；兩組間比較，a P<0.05，b P<0.01

*與NC組比較，P<0.05；a兩組間比較，P<0.05

PPARγ屬于核激素受體超家族，是一種配體應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄因子，通過配體激活實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)位而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。除參與脂質(zhì)代謝外，PPARγ在胰島素抵抗、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、纖維化等生理和病理過程中也發(fā)揮重要作用[5]。激活體內(nèi)的PPARγ可增加脂肪組織對胰島素的敏感性，促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取FFA，減少FFA向肝臟流動(dòng)，從而改善脂肪肝[6]。Soliman等[7]報(bào)道，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮可改善高血壓模型大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。另有研究[8]發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可升高妊娠期糖尿病模型小鼠的血清SOD活性和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)含量，同時(shí)降低促炎細(xì)胞因子TNF-α水平，改善模型小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥水平。關(guān)于PPARγ在NAFLD中的抗氧化活性及其具體作用機(jī)制，目前尚未完全闡明。本研究以噻唑烷二酮類PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮灌胃干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠，結(jié)果顯示羅格列酮可顯著減輕小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積、改善其體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥水平(血清MDA含量和肝臟組織IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)降低，血清SOD活性、GSH含量升高)。為進(jìn)一步探究PPARγ激動(dòng)劑改善NAFLD氧化應(yīng)激損傷的可能作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步在體外以混合FFA誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞建立脂肪變性肝細(xì)胞模型，并予PPARγ激動(dòng)劑GW1929干預(yù)。GW1929是一種新型的具有酪氨酸殘基的非噻唑烷二酮類PPARγ激動(dòng)劑，與PPARγ具有高度親和力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)FFA誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞內(nèi)ROS大量生成，氧化應(yīng)激水平明顯升高，如予GW1929預(yù)處理，肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平與未予GW1929預(yù)處理的肝細(xì)胞相比顯著降低，同時(shí)Keap1表達(dá)降低，抗氧化因子Nrf2、HO-1表達(dá)升高，各炎癥相關(guān)基因表達(dá)降低，提示PPARγ激動(dòng)劑可明顯提高脂肪變性肝細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激和抗炎能力。

Nrf2是體內(nèi)重要的參與調(diào)控抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。生理狀態(tài)下，Keap1以泛素化底物結(jié)合蛋白的形式與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，Nrf2被泛素化修飾并快速降解，從而維持體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)；在氧化應(yīng)激環(huán)境中，ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離，活化的Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合，從而上調(diào)HO-1、NAD(P)H∶醌氧化還原酶1[NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1, NQO1]等細(xì)胞保護(hù)酶和抗氧化基因表達(dá)，以對抗氧化應(yīng)激損傷[9]。在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)模型小鼠中，激活Nrf2可通過抑制氧化應(yīng)激改善炎癥和肝纖維化[10]。本研究體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GW1929預(yù)處理的脂肪變性肝細(xì)胞，Keap1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，抗氧化因子Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，提示PPARγ激動(dòng)劑激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路，從而減輕肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并可能通過此信號(hào)通路降低肝細(xì)胞炎癥水平。

綜上所述，體內(nèi)外高脂環(huán)境均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，發(fā)生顯著的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)；PPARγ激動(dòng)劑不僅能改善肝臟脂質(zhì)沉積，而且可通過減少ROS生成、激活Nrf2/HO-1抗氧化通路改善高脂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎和肝細(xì)胞保護(hù)作用。上述發(fā)現(xiàn)為PPARγ激動(dòng)劑用于NAFLD的臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。