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        ANO1抑制劑對AngⅡ誘導血管平滑肌細胞增殖影響

        2020-06-08 10:18:56朱文珍馮慢慢李浩然遲曉琦韓曉華
        青島大學學報(醫(yī)學版) 2020年2期
        關(guān)鍵詞:細胞增殖

        朱文珍 馮慢慢 李浩然 遲曉琦 韓曉華

        [摘要] 目的 探討ANO1抑制劑T16A inh-A01(A01)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的血管平滑肌細胞(VSMC)增殖及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路蛋白的影響。方法 用AngⅡ、A01處理VSMC 24 h,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞存活率,采用Western blot法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表達。結(jié)果 與對照組相比,AngⅡ使細胞存活率升高至(121.2±2.4)%,10~20 μmol/L A01能夠明顯抑制該作用(F=63.64,P<0.01)。AngⅡ處理細胞后,PCNA蛋白表達水平升高,該效應(yīng)可被20 μmol/L A01部分抑制(F=15.82,P<0.01)。此外,AngⅡ還增加了p-ERK蛋白的表達,該作用也可被A01顯著抑制(F=36.01,P<0.01)。結(jié)論 A01對AngⅡ誘導的VSMC增殖具有抑制作用,該作用可能與激活ERK信號通路相關(guān)。

        [關(guān)鍵詞] ANO1抑制劑;血管緊張素Ⅱ;血管;肌細胞,平滑肌;細胞增殖

        [中圖分類號] R544;R329.25 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532(2020)02-0190-04

        doi:10.11712/jms.2096-5532.2020.56.056 [開放科學(資源服務(wù))標識碼(OSID)]

        [網(wǎng)絡(luò)出版] http://kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200409.0847.001.html;2020-04-09 11:09

        [ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ANO1 inhibitor T16A inh-A01 (A01) on angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induced proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and extracellular regulated protein kinase (ERK) signaling pathway proteins. ?Methods VSMCs were treated with Ang Ⅱ and A01, respectively, for 24 h. The survival rate of cells was determined by MTT assay, and the protein expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and phosphorylated ERK (p-ERK) was determined by Western blot. ?Results Ang Ⅱ increased the survival rate of cells to 121.2%±2.4% (as compared with that of the control group), which could be significantly inhibited by 10-20 μmol/L A01 (F=63.64,P<0.01). After the cells were treated with Ang Ⅱ, the protein expression level of PCNA was increased, which could be partially inhibited by 20 μmol/L A01 (F=15.82,P<0.01). In addition, Ang Ⅱ increased the protein expression of p-ERK, which could also be significantly inhibited by A01 (F=36.01,P<0.01). ?Conclusion A01 can inhibit Ang Ⅱ-induced proliferation of VSMCs, which may be related to activation of the ERK signaling pathway.

        [KEY WORDS] ANO1 inhibitor; angiotensin Ⅱ; blood vessels; myocytes, smooth muscle; cell proliferation

        原發(fā)性高血壓是導致動脈粥樣硬化、腦卒中等心腦血管疾病的高危因素,因此,如何有效防治高血壓的發(fā)生發(fā)展對于預(yù)防心腦血管疾病至關(guān)重要。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是調(diào)節(jié)體液平衡和血壓的重要系統(tǒng)。大量的研究結(jié)果表明,血液循環(huán)或組織內(nèi)RAS的異常激活是導致高血壓形成和發(fā)展的重要發(fā)病機制之一[1]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性物質(zhì),不僅可以誘導血管收縮和外周血管阻力增加,還可以通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶C(PKC)、增加細胞內(nèi)活性氧(ROS)和鈣水平等信號通路,刺激血管平滑肌細胞(VSMC)的異常增殖和遷移,從而促進血管重構(gòu)的發(fā)生[2-3]。ANO1是新近發(fā)現(xiàn)的鈣激活氯通道(CaCC),在心血管系統(tǒng)有廣泛的分布[4-5]。ANO1參與血管舒縮功能的調(diào)節(jié),利用ANO1特異性抑制劑T16A inh-A01(A01)可以明顯抑制VSMC的CaCC電流,并抑制甲氧胺誘導的血管條收縮[6-7]。在肺動脈高壓研究中,ANO1促進了肺動脈血管細胞的增殖[8]。我們的前期研究顯示,AngⅡ上調(diào)了VSMC的ANO1蛋白表達,但是ANO1表達上調(diào)是否參與了AngⅡ誘導的VSMC增殖,需要進一步探討。本研究主要觀察了ANO1抑制劑A01對AngⅡ誘導的VSMC增殖的影響及ERK信號通路的變化,以期為高血壓血管重構(gòu)的防治提供新的治療策略?,F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 試劑和儀器

        AngⅡ購自ApexBio公司,A01購自Sigma公司,增殖細胞核抗原(PCNA)、ERK和磷酸化ERK(p-ERK)抗體由Cell Signaling Technology公司提供,β-actin抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品,四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Solarbio(北京)公司,DMEM高糖培養(yǎng)粉為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為BI公司產(chǎn)品,RIPA裂解液購自碧云天生物科技研究所,BCA蛋白定量檢測試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品。所用儀器包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、pectraMax M5多功能酶標儀和Western 顯影儀。

        1.2 VSMC的原代培養(yǎng)

        取體質(zhì)量100 g的Wistar大鼠,用80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,置于體積分數(shù)0.70的乙醇中浸泡后,在無菌操作臺內(nèi)迅速打開胸腔,取出胸主動脈,去除血管內(nèi)皮,將血管條剪成小塊(大小約1 mm3),置于培養(yǎng)瓶的底面貼壁5 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使組織塊浸在含體積分數(shù)為0.20胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右。VSMC在血管塊的周圍貼壁長出,當細胞達到60%~70%融合后進行傳代,選取生長狀態(tài)良好的第5~8代細胞進行實驗。

        1.3 實驗分組及藥物處理

        實驗1觀察A01對AngⅡ誘導VSMC細胞活力的影響,將細胞分為對照組(無藥物處理)、AngⅡ組(用100 μmol/L AngⅡ孵育24 h)、A01+AngⅡ組(分別用1、5、10、20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育24 h)、A01組(用20 μmol/L A01孵育24 h)。實驗2觀察A01對AngⅡ誘導的VSMC中PCNA蛋白表達的影響,將細胞分為對照組(無任何藥物處理)、AngⅡ組(用100 μmol/L AngⅡ孵育24 h)、A01+AngⅡ組(應(yīng)用20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育24 h)、A01組(用20 μmol/L A01孵育24 h)。實驗3觀察A01對AngⅡ誘導的VSMC中ERK信號通路的影響,將細胞分對照組(無藥物處理)、AngⅡ組(用100 μmol/L AngⅡ孵育5 min)、A01+AngⅡ組(用20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育5 min)以及A01組(用20 μmol/L A01孵育5 min)。

        1.4 細胞存活率檢測

        采用MTT法檢測細胞存活率。調(diào)整VSMC密度為108/L,取細胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板(每孔10 000個細胞)。藥物處理結(jié)束后,吸除培養(yǎng)液,每孔加入5 g/L MTT 20 μL繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL溶解藍色的甲瓚顆粒,室溫避光孵育10 min,用酶標儀測定波長570 nm 處的吸光度(A570)。實驗重復3次,取平均值。

        1.5 Western blot檢測PCNA、p-ERK蛋白表達

        藥物處理結(jié)束后提取蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。每個樣品以20 μg蛋白上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用100 g/L的脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h,分別加入PCNA(1∶2 000)、ERK(1∶1 000)、p-ERK(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)抗體(一抗),在4 ℃搖床上孵育過夜,以TBST洗膜3次后,加入二抗,在室溫下?lián)u床上孵育1 h,以TBST再洗膜3次后,用ECL發(fā)光劑顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以PCNA/β-actin和p-ERK/ERK的比值表示。實驗重復3次,取平均值。

        1.6 統(tǒng)計學分析

        應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所得計量資料結(jié)果以±s表示,雙因素影響組間比較采用雙因素方差分析,多因素影響組間比較采用析因設(shè)計方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) ?果

        2.1 A01對細胞存活率的影響

        對照組細胞存活率為(100.0±1.7)%,AngⅡ處理細胞24 h后細胞存活率升高至(121.2±2.4)%,1、5、10、20 μmol/L A01使細胞存活率分別降至(112.6±1.5)%、(109.9±1.5)%、(84.3±1.9)%和(78.3±1.8)%(n=3)。雙因素方差分析顯示,AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)(F=114.68,P<0.01),進而進行簡單效應(yīng)分析。20 μmol/L A01+AngⅡ組細胞存活率較AngⅡ組明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(F=63.64,P<0.01)。A01組細胞存活率為(99.0±2.0)%,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明單純應(yīng)用20 μmol/L A01處理對細胞存活率沒有明顯影響,可以排除A01毒性作用。

        2.2 A01對PCNA蛋白表達的影響

        對照組、AngⅡ組、A01+AngⅡ組、A01組細胞PCNA蛋白表達水平分別為(100.0±4.1)%、(161.8±8.1)%、(106.2±1.4)%和(100.0±10.4)%(n=3)。析因設(shè)計方差分析顯示,AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)(F=15.94,P<0.01),進而進行簡單效應(yīng)分析。AngⅡ組與對照組相比PCNA蛋白表達明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(F=23.65,P<0.01);與AngⅡ組相比,A01+AngⅡ組PCNA蛋白表達下降,差異具有統(tǒng)計學意義(F=15.82,P<0.01),而單獨使用A01對PCNA蛋白表達沒有明顯影響(P>0.05)。見圖1。

        2.3 A01對p-ERK蛋白表達的影響

        對照組、AngⅡ組、A01+AngⅡ組、A01組細胞p-ERK蛋白的表達水平分別為(100.0±0.6)%、(154.3±8.3)%、(90.1±10.3)%和(97.0±3.8)%(n=3)。析因設(shè)計方差分析顯示,AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)(F=8.15,P<0.05),進而進行簡單效應(yīng)分析。與對照組相比,AngⅡ組p-ERK蛋白表達明顯上調(diào)(F=21.50,P<0.01);與AngⅡ組相比,A01+AngⅡ組蛋白表達明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(F=36.01,P<0.01);而單獨使用A01對p-ERK蛋白表達沒有明顯影響(P>0.05)。見圖2。

        3 討 ?論

        長期的高血壓會引起血管結(jié)構(gòu)和功能的改變,即血管重構(gòu),是導致高血壓惡化發(fā)展和靶器官損傷的重要病理生理學基礎(chǔ)[9]。血管重構(gòu)通過細胞增殖、凋亡和遷移以及細胞外基質(zhì)重排而改變血管結(jié)構(gòu)和功能,其中VSMC作為血管壁的主體細胞,其增殖及收縮功能增強在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[10]。VSMC增殖和血管纖維化是血管重塑和硬化的兩個重要變化,是高血壓發(fā)生和發(fā)展的動力[11-13]。

        AngⅡ為RAS中的最主要的活性物質(zhì),血液循環(huán)和血管壁局部產(chǎn)生的AngⅡ可結(jié)合血管緊張素1型受體(AT1R),通過激活PLC/IP3、PKC、MAPK等多條信號通路,促進VSMC的蛋白和DNA合成以及細胞遷移[14]。AngⅡ作為有絲分裂原,能夠加速細胞周期進程[15],刺激VSMC蛋白合成,使得VSMC異常增殖[16],導致血管重構(gòu)。ANO1存在于血管平滑肌的各個部位[17-18],是血管平滑肌上的CaCC,可以參與血管功能的調(diào)節(jié)。有文獻報道,ANO1高表達促進了肺血管的重構(gòu)[4]。ANO1有助于增強人類心臟成纖維細胞中的CaCC電流,并且這受AngⅡ通過AT1R途徑的作用所調(diào)節(jié)[19]。高血壓大鼠血管組織中ANO1是高表達的,并且ANO1可促進細胞增殖[20]。研究表明,ANO1參與VSMC的增殖和高血壓誘導的腦血管重塑[21]。我們的前期實驗已表明,AngⅡ增加了正常大鼠原代培養(yǎng)VSMC上ANO1的表達,提示ANO1可能參與了AngⅡ誘導的VSMC的增殖過程。PCNA是評價細胞是否處于增殖狀態(tài)的重要標記[22],其表達水平可反映VSMC的增殖活性。本文的研究結(jié)果顯示,ANO1抑制劑A01能夠顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC的活性及PCNA蛋白表達。以上結(jié)果提示,在VSMC中AngⅡ通過增加細胞活性促進增殖,并且AngⅡ與ANO1之間相互促進,共同參與了高血壓的發(fā)展。

        ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。ERK信號通路由有絲分裂原刺激激活并在調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中具有重要地位。ERK信號通路參與多種生物學反應(yīng),包括刺激生長因子的釋放,參與細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控等。其中細胞增殖主要體現(xiàn)在細胞數(shù)量增加和PCNA蛋白表達水平升高。ERK信號通路參與調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖已經(jīng)被證實[23],ERK1/2激活影響VSMC增殖肥大[24-26]。越來越多的研究表明,VSMC增殖、遷移通過ERK信號通路實現(xiàn)[27]。

        本文研究結(jié)果表明,A01通過抑制ERK信號途徑抑制由AngⅡ誘導的VSMC增殖。當局部的RAS功能增強時,AngⅡ通過ERK信號通路使得ANO1高表達,VSMC異常增殖,導致高血壓血管重構(gòu)。ANO1對心血管功能的調(diào)控是國際上新的研究熱點,阻斷或逆轉(zhuǎn)高血壓血管重構(gòu)是高血壓防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié),希望本實驗結(jié)果能為高血壓血管重構(gòu)的防治提供新的治療策略。

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        (本文編輯 馬偉平)

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