朱文珍 馮慢慢 李浩然 遲曉琦 韓曉華

[摘要] 目的 探討ANO1抑制劑T16A inh-A01（A01）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的血管平滑肌細胞（VSMC）增殖及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路蛋白的影響。方法 用AngⅡ、A01處理VSMC 24 h，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞存活率，采用Western blot法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表達。結(jié)果 與對照組相比，AngⅡ使細胞存活率升高至（121.2±2.4）%，10～20 μmol/L A01能夠明顯抑制該作用（F=63.64，P<0.01）。AngⅡ處理細胞后，PCNA蛋白表達水平升高，該效應(yīng)可被20 μmol/L A01部分抑制（F=15.82，P<0.01）。此外，AngⅡ還增加了p-ERK蛋白的表達，該作用也可被A01顯著抑制（F=36.01，P<0.01）。結(jié)論 A01對AngⅡ誘導的VSMC增殖具有抑制作用，該作用可能與激活ERK信號通路相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] ANO1抑制劑;血管緊張素Ⅱ;血管;肌細胞，平滑肌;細胞增殖

[中圖分類號] R544;R329.25 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0190-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.056 [開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200409.0847.001.html;2020-04-09 11：09

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ANO1 inhibitor T16A inh-A01 （A01） on angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）-induced proliferation of vascular smooth muscle cells （VSMCs） and extracellular regulated protein kinase （ERK） signaling pathway proteins. ?Methods VSMCs were treated with Ang Ⅱ and A01， respectively， for 24 h. The survival rate of cells was determined by MTT assay， and the protein expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and phosphorylated ERK （p-ERK） was determined by Western blot. ?Results Ang Ⅱ increased the survival rate of cells to 121.2%±2.4% （as compared with that of the control group）， which could be significantly inhibited by 10-20 μmol/L A01 （F=63.64，P<0.01）. After the cells were treated with Ang Ⅱ， the protein expression level of PCNA was increased， which could be partially inhibited by 20 μmol/L A01 （F=15.82，P<0.01）. In addition， Ang Ⅱ increased the protein expression of p-ERK， which could also be significantly inhibited by A01 （F=36.01，P<0.01）. ?Conclusion A01 can inhibit Ang Ⅱ-induced proliferation of VSMCs， which may be related to activation of the ERK signaling pathway.

[KEY WORDS] ANO1 inhibitor; angiotensin Ⅱ; blood vessels; myocytes， smooth muscle; cell proliferation

原發(fā)性高血壓是導致動脈粥樣硬化、腦卒中等心腦血管疾病的高危因素，因此，如何有效防治高血壓的發(fā)生發(fā)展對于預(yù)防心腦血管疾病至關(guān)重要。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是調(diào)節(jié)體液平衡和血壓的重要系統(tǒng)。大量的研究結(jié)果表明，血液循環(huán)或組織內(nèi)RAS的異常激活是導致高血壓形成和發(fā)展的重要發(fā)病機制之一[1]。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是RAS的主要活性物質(zhì)，不僅可以誘導血管收縮和外周血管阻力增加，還可以通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和蛋白激酶C（PKC）、增加細胞內(nèi)活性氧（ROS）和鈣水平等信號通路，刺激血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖和遷移，從而促進血管重構(gòu)的發(fā)生[2-3]。ANO1是新近發(fā)現(xiàn)的鈣激活氯通道（CaCC），在心血管系統(tǒng)有廣泛的分布[4-5]。ANO1參與血管舒縮功能的調(diào)節(jié)，利用ANO1特異性抑制劑T16A inh-A01（A01）可以明顯抑制VSMC的CaCC電流，并抑制甲氧胺誘導的血管條收縮[6-7]。在肺動脈高壓研究中，ANO1促進了肺動脈血管細胞的增殖[8]。我們的前期研究顯示，AngⅡ上調(diào)了VSMC的ANO1蛋白表達，但是ANO1表達上調(diào)是否參與了AngⅡ誘導的VSMC增殖，需要進一步探討。本研究主要觀察了ANO1抑制劑A01對AngⅡ誘導的VSMC增殖的影響及ERK信號通路的變化，以期為高血壓血管重構(gòu)的防治提供新的治療策略?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

AngⅡ購自ApexBio公司，A01購自Sigma公司，增殖細胞核抗原（PCNA）、ERK和磷酸化ERK（p-ERK）抗體由Cell Signaling Technology公司提供，β-actin抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Solarbio（北京）公司，DMEM高糖培養(yǎng)粉為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為BI公司產(chǎn)品，RIPA裂解液購自碧云天生物科技研究所，BCA蛋白定量檢測試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品。所用儀器包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、pectraMax M5多功能酶標儀和Western 顯影儀。

1.2 VSMC的原代培養(yǎng)

取體質(zhì)量100 g的Wistar大鼠，用80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，置于體積分數(shù)0.70的乙醇中浸泡后，在無菌操作臺內(nèi)迅速打開胸腔，取出胸主動脈，去除血管內(nèi)皮，將血管條剪成小塊（大小約1 mm3），置于培養(yǎng)瓶的底面貼壁5 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸在含體積分數(shù)為0.20胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右。VSMC在血管塊的周圍貼壁長出，當細胞達到60%～70%融合后進行傳代，選取生長狀態(tài)良好的第5～8代細胞進行實驗。

1.3 實驗分組及藥物處理

實驗1觀察A01對AngⅡ誘導VSMC細胞活力的影響，將細胞分為對照組（無藥物處理）、AngⅡ組（用100 μmol/L AngⅡ孵育24 h）、A01+AngⅡ組（分別用1、5、10、20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育24 h）、A01組（用20 μmol/L A01孵育24 h）。實驗2觀察A01對AngⅡ誘導的VSMC中PCNA蛋白表達的影響，將細胞分為對照組（無任何藥物處理）、AngⅡ組（用100 μmol/L AngⅡ孵育24 h）、A01+AngⅡ組（應(yīng)用20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育24 h）、A01組（用20 μmol/L A01孵育24 h）。實驗3觀察A01對AngⅡ誘導的VSMC中ERK信號通路的影響，將細胞分對照組（無藥物處理）、AngⅡ組（用100 μmol/L AngⅡ孵育5 min）、A01+AngⅡ組（用20 μmol/L A01和100 μmol/L AngⅡ孵育5 min）以及A01組（用20 μmol/L A01孵育5 min）。

1.4 細胞存活率檢測

采用MTT法檢測細胞存活率。調(diào)整VSMC密度為108/L，取細胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板（每孔10 000個細胞）。藥物處理結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L MTT 20 μL繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL溶解藍色的甲瓚顆粒，室溫避光孵育10 min，用酶標儀測定波長570 nm 處的吸光度（A570）。實驗重復3次，取平均值。

1.5 Western blot檢測PCNA、p-ERK蛋白表達

藥物處理結(jié)束后提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。每個樣品以20 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用100 g/L的脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，分別加入PCNA（1∶2 000）、ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）抗體（一抗），在4 ℃搖床上孵育過夜，以TBST洗膜3次后，加入二抗，在室溫下?lián)u床上孵育1 h，以TBST再洗膜3次后，用ECL發(fā)光劑顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以PCNA/β-actin和p-ERK/ERK的比值表示。實驗重復3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所得計量資料結(jié)果以±s表示，雙因素影響組間比較采用雙因素方差分析，多因素影響組間比較采用析因設(shè)計方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) ?果

2.1 A01對細胞存活率的影響

對照組細胞存活率為（100.0±1.7）%，AngⅡ處理細胞24 h后細胞存活率升高至（121.2±2.4）%，1、5、10、20 μmol/L A01使細胞存活率分別降至（112.6±1.5）%、（109.9±1.5）%、（84.3±1.9）%和（78.3±1.8）%（n=3）。雙因素方差分析顯示，AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)（F=114.68，P<0.01），進而進行簡單效應(yīng)分析。20 μmol/L A01+AngⅡ組細胞存活率較AngⅡ組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（F=63.64，P<0.01）。A01組細胞存活率為（99.0±2.0）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明單純應(yīng)用20 μmol/L A01處理對細胞存活率沒有明顯影響，可以排除A01毒性作用。

2.2 A01對PCNA蛋白表達的影響

對照組、AngⅡ組、A01+AngⅡ組、A01組細胞PCNA蛋白表達水平分別為（100.0±4.1）%、（161.8±8.1）%、（106.2±1.4）%和（100.0±10.4）%（n=3）。析因設(shè)計方差分析顯示，AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)（F=15.94，P<0.01），進而進行簡單效應(yīng)分析。AngⅡ組與對照組相比PCNA蛋白表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（F=23.65，P<0.01）;與AngⅡ組相比，A01+AngⅡ組PCNA蛋白表達下降，差異具有統(tǒng)計學意義（F=15.82，P<0.01），而單獨使用A01對PCNA蛋白表達沒有明顯影響（P>0.05）。見圖1。

2.3 A01對p-ERK蛋白表達的影響

對照組、AngⅡ組、A01+AngⅡ組、A01組細胞p-ERK蛋白的表達水平分別為（100.0±0.6）%、（154.3±8.3）%、（90.1±10.3）%和（97.0±3.8）%（n=3）。析因設(shè)計方差分析顯示，AngⅡ和A01兩種因素存在交互效應(yīng)（F=8.15，P<0.05），進而進行簡單效應(yīng)分析。與對照組相比，AngⅡ組p-ERK蛋白表達明顯上調(diào)（F=21.50，P<0.01）;與AngⅡ組相比，A01+AngⅡ組蛋白表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（F=36.01，P<0.01）;而單獨使用A01對p-ERK蛋白表達沒有明顯影響（P>0.05）。見圖2。

3 討 ?論

長期的高血壓會引起血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，即血管重構(gòu)，是導致高血壓惡化發(fā)展和靶器官損傷的重要病理生理學基礎(chǔ)[9]。血管重構(gòu)通過細胞增殖、凋亡和遷移以及細胞外基質(zhì)重排而改變血管結(jié)構(gòu)和功能，其中VSMC作為血管壁的主體細胞，其增殖及收縮功能增強在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[10]。VSMC增殖和血管纖維化是血管重塑和硬化的兩個重要變化，是高血壓發(fā)生和發(fā)展的動力[11-13]。

AngⅡ為RAS中的最主要的活性物質(zhì)，血液循環(huán)和血管壁局部產(chǎn)生的AngⅡ可結(jié)合血管緊張素1型受體（AT1R），通過激活PLC/IP3、PKC、MAPK等多條信號通路，促進VSMC的蛋白和DNA合成以及細胞遷移[14]。AngⅡ作為有絲分裂原，能夠加速細胞周期進程[15]，刺激VSMC蛋白合成，使得VSMC異常增殖[16]，導致血管重構(gòu)。ANO1存在于血管平滑肌的各個部位[17-18]，是血管平滑肌上的CaCC，可以參與血管功能的調(diào)節(jié)。有文獻報道，ANO1高表達促進了肺血管的重構(gòu)[4]。ANO1有助于增強人類心臟成纖維細胞中的CaCC電流，并且這受AngⅡ通過AT1R途徑的作用所調(diào)節(jié)[19]。高血壓大鼠血管組織中ANO1是高表達的，并且ANO1可促進細胞增殖[20]。研究表明，ANO1參與VSMC的增殖和高血壓誘導的腦血管重塑[21]。我們的前期實驗已表明，AngⅡ增加了正常大鼠原代培養(yǎng)VSMC上ANO1的表達，提示ANO1可能參與了AngⅡ誘導的VSMC的增殖過程。PCNA是評價細胞是否處于增殖狀態(tài)的重要標記[22]，其表達水平可反映VSMC的增殖活性。本文的研究結(jié)果顯示，ANO1抑制劑A01能夠顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC的活性及PCNA蛋白表達。以上結(jié)果提示，在VSMC中AngⅡ通過增加細胞活性促進增殖，并且AngⅡ與ANO1之間相互促進，共同參與了高血壓的發(fā)展。

ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族。ERK信號通路由有絲分裂原刺激激活并在調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中具有重要地位。ERK信號通路參與多種生物學反應(yīng)，包括刺激生長因子的釋放，參與細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控等。其中細胞增殖主要體現(xiàn)在細胞數(shù)量增加和PCNA蛋白表達水平升高。ERK信號通路參與調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖已經(jīng)被證實[23]，ERK1/2激活影響VSMC增殖肥大[24-26]。越來越多的研究表明，VSMC增殖、遷移通過ERK信號通路實現(xiàn)[27]。

本文研究結(jié)果表明，A01通過抑制ERK信號途徑抑制由AngⅡ誘導的VSMC增殖。當局部的RAS功能增強時，AngⅡ通過ERK信號通路使得ANO1高表達，VSMC異常增殖，導致高血壓血管重構(gòu)。ANO1對心血管功能的調(diào)控是國際上新的研究熱點，阻斷或逆轉(zhuǎn)高血壓血管重構(gòu)是高血壓防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，希望本實驗結(jié)果能為高血壓血管重構(gòu)的防治提供新的治療策略。

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（本文編輯 馬偉平）