王宇龍 尚千鉛 張帆 楊海燕 楚海嬌

摘 要：以玉米干種子為提取材料，采用磁性納米微球作為吸附介質(zhì)進(jìn)行基因組DNA的提取，分別探討不同裂解液、裂解溫度、時(shí)間和磁珠用量對(duì)基因組DNA提取效率的影響。結(jié)果表明裂解液2%CTAB、裂解溫度65 ℃、裂解時(shí)間10 min、磁珠用量15 ?L時(shí)基因組DNA提取濃度高、純度好、適宜后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：玉米;DNA;提取

Abstract：Using maize seeds as materials， extracted the genomic DNA by magnetic nanospheres.The results showed that when the lysate was 2%CTAB， the pyrolysis temperature was 65 ℃， the time was 10 min and the dosage of magnetic beads was 15 ?L， the genomic DNA extraction concentration was high， the purity was good， and it was suitable for subsequent experiments.

Key words：Maize; DNA; Extraction

玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測主要是基于基因水平的檢測，PCR技術(shù)是常用的檢測手段，而高質(zhì)量的DNA是后續(xù)PCR檢測成功與否的前提條件[1]。針對(duì)玉米的DNA提取最常用的方法是CTAB法，而傳統(tǒng)的提取方法存在操作過程繁瑣、耗時(shí)耗力、使用有毒溶劑及不能自動(dòng)化提取等缺點(diǎn)[2]。為克服以上缺點(diǎn)，本試驗(yàn)采用近年來在核酸分離純化領(lǐng)域備受矚目的磁珠分離技術(shù)，以玉米干種子為提取材料進(jìn)行DNA提取，同時(shí)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種玉米干種子DNA提取的磁性分離方法，旨為玉米轉(zhuǎn)基因快速檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米干種子，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院提供;磁珠，由吉林化工學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

取玉米干種子若干粒，于粉碎機(jī)中粉碎成粉末。

1.2.2 提取步驟

①稱取0.04 g玉米粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有400 μL裂解液的無菌離心管中，迅速顛倒混勻。②水浴10 min，每隔5 min顛倒混勻。③12 000 r·min-1離心5 min后將上清液移至新的1.5 mL無菌離心管中。④加入與上清液等體積的異丙醇及一定體積的磁珠工作液，振蕩混勻。⑤用磁分離架分離磁珠并棄上清。⑥加入900 μL漂洗液洗滌3次，分離磁珠棄上清，吹干磁珠后加入100 μL洗脫液，充分混勻，65 ℃水浴10 min。⑦轉(zhuǎn)移至磁力架上吸附2 min，待磁珠完全吸附后，將溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于-20 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂解液對(duì)DNA提取效果的影響

細(xì)胞的充分裂解是獲得高質(zhì)量DNA的前提。本試驗(yàn)配制7種提取裂解液對(duì)玉米干種子進(jìn)行DNA提取，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測量濃度和純度，結(jié)果見表1。裂解液Ⅰ的濃度最低，裂解液Ⅱ次之;以CTAB作為裂解液時(shí)DNA濃度均較高，而單獨(dú)使用2%CTAB提取時(shí)濃度最高;加入不同摩爾濃度的鹽酸胍后DNA濃度沒有提高。采用7種裂解液提取的DNA純度均較好，除使用SDS裂解液的OD260/OD280為2.08，存在少量RNA污染外，其他比值均在1.8～2.0。純凈DNA樣本的OD260/OD230應(yīng)該大于2，采用鹽酸胍和異硫氰酸胍作為裂解液的比值分別為1.62和0.22，可能存在鹽離子或胍鹽殘留。結(jié)合電泳圖1可見3～6號(hào)泳道DNA條帶明亮清晰，無拖尾彌散現(xiàn)象，完整性好。因此，認(rèn)為2%CTAB為最佳裂解液。

2.2 裂解溫度對(duì)DNA提取效果的影響

為獲得最佳裂解溫度，分別采用55、65、70 ℃和75 ℃對(duì)玉米干種子進(jìn)行DNA提取比較，結(jié)果見表2。裂解溫度為70 ℃時(shí)，DNA樣本濃度最高;65℃時(shí)最低;4種裂解溫度下DNA樣品均無蛋白質(zhì)和RNA污染，但OD260/OD230存在差異，只有在65 ℃時(shí)，比值大于2.0，這可能與其濃度相對(duì)較低，攜帶雜質(zhì)較少有關(guān)。由圖2可見，4條電泳條帶均清晰整齊，雖然2號(hào)泳道的條帶偏暗，濃度略低，但其純度最好，且其提取濃度足以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。因此選擇65 ℃作為最佳裂解溫度。

2.3 裂解時(shí)間對(duì)DNA提取效果的影響

裂解時(shí)間影響DNA的提取質(zhì)量，分別選擇5、10、20 min和30 min進(jìn)行DNA提取，結(jié)果見表3。裂解時(shí)間為10 min時(shí)，濃度最高;隨裂解時(shí)間增長，濃度降低。OD260 nm/OD280 nm均在1.9～2.0，符合濃度要求。而OD260 nm/OD230 nm存在差異，只有裂解時(shí)間為10 min時(shí)，比值大于2，說明純度較好;裂解5 min時(shí)，OD260 nm/OD230 nm為11.90，可能存在其他成分干擾或者洗滌后殘余乙醇所致。結(jié)合電泳圖3發(fā)現(xiàn)，4條電泳條帶均整齊清晰，完整性好。綜合認(rèn)為，裂解時(shí)間為10 min較合適。

2.4 磁珠體積對(duì)DNA提取效果的影響

在其他提取條件相同的情況下，分別加入10、15、20 μL和25 μL的磁珠進(jìn)行DNA提取，結(jié)果見表4。加入15 μL磁珠時(shí)，DNA含量最高;隨體積增加，DNA含量下降。磁珠體積為15 μL時(shí)，DNA較純凈，而其他3組DNA存在不同程度的污染。結(jié)合圖4認(rèn)為，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)使用的磁珠類型，選擇15 μL的磁珠體積較合適。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選取玉米干種子作為提取材料避免了種子萌發(fā)周期較長的問題，取材更加方便[3]。對(duì)裂解液進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用2%CTAB進(jìn)行提取時(shí)DNA質(zhì)量最好，這也是傳統(tǒng)玉米DNA提取方法中使用最廣泛的細(xì)胞裂解液;采用CTAB和鹽酸胍組合裂解時(shí)發(fā)現(xiàn)加入鹽酸胍后DNA質(zhì)量沒有提高，因此為節(jié)約成本，確定2%CTAB為最佳細(xì)胞裂解液;試驗(yàn)確定65 ℃為最佳裂解溫度，與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相吻合;裂解時(shí)間為10 min時(shí)，DNA質(zhì)量最好，隨著裂解時(shí)間延長，DNA含量和純度逐漸下降，說明裂解時(shí)間過長，可能造成DNA降解;而裂解時(shí)間過短，DNA不能充分釋放出來[4];最佳磁珠體積為15 ?L。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳笑蕓，汪小福，周育等.轉(zhuǎn)基因大豆深加工食品DNA鑒定技術(shù)研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2013，13（4）：156-162.

[2]趙衛(wèi)東，鄭文杰，王愛迪等.磁性微球在植物源性轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（6）：128-130.

[3]魏琦超，暢麗萍，周巖等.利用改良CTAB法提取小麥干種子總DNA[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：30-32.

[4]劉 捷.植物基因組DNA提取試劑盒提取玉米基因組DNA的條件優(yōu)化[J].種子世界，2017（11）：22-23.