張潔茹，葉淑紅，羅明洋，張 彧*，羅連富

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；3.大連富森智能科技有限公司，遼寧大連 116034）

黑木耳（Auricularia auricular）是一種營養(yǎng)豐富的食用菌，已有眾多研究表明其富含粗蛋白、粗多糖、腺苷類物質(zhì)、膳食纖維、黃酮、維生素K、纖維素和多種人體必備礦物質(zhì)元素等[1-2]。同時(shí)黑木耳有多種生物學(xué)活性以及很高的藥理價(jià)值，有清除自由基、群體感應(yīng)等功能，對(duì)預(yù)防和減緩高血壓、高血脂也有積極作用[3-4]。白刺果（Nitraria tangutorum）是在中國干旱地區(qū)廣泛種植的一種灌木植物，有“沙漠櫻桃”之稱。果實(shí)中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全[5]。維生素、有機(jī)酸和鈣、鐵、鋅等微量元素也十分充足，含有安全無毒的天然紅色素，有較高的應(yīng)用價(jià)值[6]。

近年來，發(fā)酵飲料行業(yè)受到越來越多關(guān)注，由于擁有特定的營養(yǎng)功效和口感，發(fā)酵技術(shù)已被應(yīng)用到很多軟飲料中[7]。其中，乳酸菌應(yīng)用極其廣泛。乳酸菌的發(fā)酵可以減緩果（Lactobacillus plantarum）蔬中酚類物質(zhì)的分解，提高抗氧化的能力[8-9]。植物乳桿菌作為最常見的乳酸菌之一，常用于發(fā)酵食品中，具有多種益生作用，如改善胃腸道功能、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)生物屏障、降膽固醇及吸附重金屬等[10]。與乳制品為原料相比，以食用菌和水果為原料進(jìn)行發(fā)酵是乳酸菌發(fā)酵未來的發(fā)展趨勢(shì)[11]。

本實(shí)驗(yàn)選取黑木耳和白刺果為原料，經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵，制備黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料，并采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化乳酸發(fā)酵工藝，確定發(fā)酵工藝參數(shù)。不僅讓我國豐富的木耳資源得到充分利用，還添加白刺果來改善產(chǎn)品顏色，調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味，使復(fù)合乳酸飲料克服了單一木耳發(fā)酵在感官品質(zhì)上的不足。且乳酸發(fā)酵賦予了飲料獨(dú)特的口感，既可以滿足消費(fèi)者口味的差異化，也滿足生物技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，為乳酸菌飲料的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；白刺果：都蘭海枝紅生物科技有限責(zé)任公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實(shí)驗(yàn)室保藏；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（化學(xué)純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硼酸（分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722S 可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-211B 恒溫?fù)u床：上海智誠分析儀器制造有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理機(jī)：九陽股份有限公司；SHP-150 生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SX-500壓力蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；JJ-2 組織搗碎勻漿機(jī)：江蘇杰瑞爾電器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；WYA-2W雙目數(shù)字阿貝折射儀：上海精科儀電物光儀器有限公司；QN-30壓蓋機(jī)：湖南省科特包裝檢測(cè)技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料加工工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

挑選、水洗、浸泡：選擇干凈無雜質(zhì)、無霉變的優(yōu)質(zhì)黑木耳，粒大、飽滿、無雜質(zhì)的白刺果，取適量的水洗滌干凈，木耳放入足量的水中浸泡50～60 min，待其完全泡發(fā)膨脹，備用。

打漿、過濾：黑木耳和白刺果質(zhì)量比為5∶1，按所需用量稱取泡發(fā)后的黑木耳和白刺果。此時(shí)原料打漿后還原糖含量為8.21 mg/mL，可以為植物乳桿菌發(fā)酵提供充分的碳源[12]。原料與水按1∶8（g∶mL）的固液比加水，打漿。打漿后的混合原漿，用四層紗布過濾獲得濾液。

殺菌：混合漿液在65 ℃下殺菌30 min。

乳酸菌發(fā)酵：混合漿液的植物乳桿菌接種量為2%（V/V），在37 ℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行發(fā)酵，待63 h后發(fā)酵結(jié)束。

均質(zhì)、離心：發(fā)酵原液在8 000 r/min條件下均質(zhì)5 min。再放入離心機(jī)10 000 r/min條件下離心15 min。

風(fēng)味調(diào)配、灌裝：澄清發(fā)酵液中加入14%的蔗糖，待完全溶解后裝入容器中，用壓蓋機(jī)封口。

殺菌、冷卻：灌裝后的發(fā)酵液在65 ℃下殺菌30 min，取出冷卻至常溫，即可得到黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料。

1.3.3 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

飲料于37 ℃、120 r/min下發(fā)酵，分別考察植物乳桿菌接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（V/V））、原料和水的比例（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL））、發(fā)酵時(shí)間（40 h、48 h、56 h、64 h、72 h）、裝液量（30%、40%、50%、60%、70%），對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響。

1.3.4 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇固液比（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、裝液量（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Bohnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)。Box-Bohnken試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 測(cè)定方法

還原糖含量測(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸法[13]（還原糖利用率=（發(fā)酵前原液中還原糖量-發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖量）/發(fā)酵前原液中還原糖量×100%）；可溶性固形物測(cè)定：采用折光計(jì)法[14]；總酸含量測(cè)定：采用酸堿滴定法[15]；γ-氨基丁酸含量測(cè)定：采用比色法[16]。

微生物指標(biāo)測(cè)定：按照國標(biāo)GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定》、GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB 29921—2013《食品中致病菌限量》進(jìn)行測(cè)定[17-19]。

1.3.6 感官評(píng)分方法

感官評(píng)定參照QB/T 5323—2018《植物酵素》中規(guī)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[20]，滿分10分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of compound lactic acid bacteria beverage of Auricularia auricular and Nitraria tangutorum

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin、Design ExpertV8.0.6等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量的影響

圖1 不同接種量對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖1可知，接種量＜2.0%之前，植物乳桿菌產(chǎn)少量的黏性物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生不利影響，且復(fù)合發(fā)酵液中乳酸發(fā)酵不徹底，導(dǎo)致乳酸轉(zhuǎn)化率較低；接種量在2.0%時(shí)，還原糖利用率達(dá)到27.7%，其感官評(píng)分也最高，為7.0分；接種量在2.5%時(shí)，菌體之間競爭能力強(qiáng)，消耗營養(yǎng)也更多，用于生成乳酸的底物較少，不利于乳酸形成，還原糖利用率大幅下降；接種量在3.0%時(shí)，部分乳酸菌種在競爭中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，使得還原糖的利用率再次上升，但發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)充分利用后產(chǎn)酸不再增加[21]。因此，植物乳桿菌最佳接種量為2.0%。

2.1.2 固液比的影響

圖2 不同固液比對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of different solid-liquid ratio on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖2可知，固液比在1∶6（g∶mL）與1∶7（g∶mL）時(shí)，加入到原料中的水量過少，導(dǎo)致原料在植物乳桿菌發(fā)酵時(shí)還原糖的浸出不完全，還原糖利用不足。發(fā)酵液較濃稠，流動(dòng)性較差，口感欠佳；當(dāng)固液比為1∶8（g∶mL）時(shí)，植物乳桿菌對(duì)還原糖的利用率及感官評(píng)分最高，分別為39.5%、7.2分。而固液比在1∶9（g∶mL）和1∶10（g∶mL）時(shí)，由于加入的水量過多，對(duì)原液的稀釋倍數(shù)過大，最終的發(fā)酵液較稀，味道寡淡，風(fēng)味欠缺。因此，最佳固液比為1∶8（g∶mL）。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵原液產(chǎn)品風(fēng)味的關(guān)鍵所在。因?yàn)槿樗峋挟a(chǎn)酸的作用，若時(shí)間過短，發(fā)酵原液中酸少醇多，口感欠佳；若發(fā)酵時(shí)間過長，發(fā)酵原液中酸多醇少，同樣影響品質(zhì)[26]。

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＜64 h之前，還原糖利用率和感官評(píng)分呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。發(fā)酵至40 h，還原糖的利用率僅有8.2%，感官評(píng)分為5.7分；發(fā)酵48 h時(shí)，還原糖利用率上升至17.5%，感官評(píng)分為6.5分；發(fā)酵56 h時(shí)，還原糖利用率為35.0%，感官評(píng)分7.4分。當(dāng)發(fā)酵至64 h時(shí)，還原糖的利用率達(dá)43.9%，感官評(píng)分最高，為8.0分；發(fā)酵時(shí)間＞64 h之后，還原糖利用率上升趨勢(shì)平緩，發(fā)酵從64 h到72 h，還原糖利用率僅上升1.8%。因?yàn)槲锪现袪I養(yǎng)有限，發(fā)酵已接近尾聲。但其感官評(píng)分下降至7.5分。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為64 h。

2.1.4 裝液量的影響

植物乳桿菌是異養(yǎng)厭氧型微生物，當(dāng)瓶內(nèi)氧氣耗盡后開始無氧呼吸[22]。

圖4 不同裝液量對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of different liquid-loading volume on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖4可知，裝液量＜60%之前，還原糖利用率不斷升高，感官評(píng)分也隨之增加。裝液量由40%升高到50%的過程中，其還原糖利用率變化最大，由31.5%迅速提高到50.01%。感官評(píng)分在此時(shí)間內(nèi)也由6.4分提升到7.5分；裝液量為60%時(shí)，還原糖利用率最高，達(dá)50.88%。同時(shí)產(chǎn)品感官評(píng)分也最高，為8.5分，此時(shí)酸度易被接受，口感清爽；裝液量＞60%之后，還原糖利用率及感官評(píng)分均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最適裝液量為60%。

2.2 黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

采用Box-Bohnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分的影響，借助Design ExpertV8.0.6軟件進(jìn)行分析。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定接種量為2%（V/V），選取對(duì)還原糖利用率和感官評(píng)分影響較大的3個(gè)因素：固液比（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、裝液量（C），以感官分?jǐn)?shù)為（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Bohnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸方程顯著性檢驗(yàn)與方差分析Table 4 Significance test and variance analysis of regression equation

通過Design ExpertV8.0.6軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，獲得固液比（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、裝液量（C）對(duì)黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料感官評(píng)分（Y）的回歸方程：

由表4可知，回歸方程模型P值為0.000 1＜0.01，極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.473 3＞0.05，不顯著；說明建立的回歸方程擬合良好。決定系數(shù)R2=0.991 7，說明99.17%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋。該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎糜诖_定黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料的最佳工藝。對(duì)感官評(píng)分影響次序依次為發(fā)酵時(shí)間＞固液比＞裝液量，其中一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A、C及交互AB相對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著。

2.2.2 因素交互作用響應(yīng)面分析

固液比、發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)白刺果復(fù)合乳酸菌飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 固液比、裝液量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合乳酸菌飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid-liquid ratio,liquid-loading volume and fermentation time on sensory evaluation of compound lactic acid bacteria beverage

由圖5可知，各因素在植物乳桿菌發(fā)酵過程的交互作用，AB交互作用差異顯著，其表現(xiàn)為等高線形狀為橢圓形。AC和BC交互作用不顯著，等高線形狀為圓形。發(fā)酵時(shí)間與固液比響應(yīng)面曲線相對(duì)較陡，因此對(duì)感官的影響最顯著；而發(fā)酵時(shí)間與裝液量、固液比與裝液量曲線較為平緩，響應(yīng)值變化隨其數(shù)值的變化較小，因此對(duì)感官評(píng)分影響較小。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design ExpertV8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，獲得的最佳發(fā)酵工藝為：固液比1∶8（g∶mL），發(fā)酵時(shí)間63 h，裝液量58%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到產(chǎn)品的感官評(píng)分的實(shí)際值為9.1分，與理論預(yù)測(cè)值9.06分相近。綜上，說明實(shí)驗(yàn)所得模型與實(shí)際情況擬合程度良好，能夠較好地反映出固液比、發(fā)酵時(shí)間和裝液量與復(fù)合發(fā)酵原液感官評(píng)分之間的關(guān)系，可采用該模型對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)分進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 感官指標(biāo)

產(chǎn)品呈亮紅褐色，酸甜適中，口感柔和細(xì)膩，擁有黑木耳白刺果的天然風(fēng)味和乳酸發(fā)酵的特殊香氣。

2.3.2 理化指標(biāo)

在最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的黑木耳白刺果復(fù)合乳酸菌飲料還原糖含量為3.80 mg/mL，總酸度為2.48 g/100 mL，可溶性固形物含量為4.5%，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL。

2.3.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

3 結(jié)論

本研究以食用菌黑木耳為主要原料，搭配白刺果，采用植物乳桿菌發(fā)酵，研究了復(fù)合原液的發(fā)酵工藝。通過單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了黑木耳白刺果復(fù)合發(fā)酵原液的工藝條件，確定最終的工藝參數(shù)為：木耳、白刺果質(zhì)量比5∶1，固液比1∶8（g∶mL），植物乳桿菌發(fā)酵階段接種量2.0%（V/V），于37 ℃下發(fā)酵時(shí)間63 h，裝液量為58%。在此優(yōu)化條件下，復(fù)合乳酸菌飲料感官評(píng)分為9.1分，還原糖含量為3.80mg/mL，酸度為2.48 g/100 mL，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL，顏色為紅褐色，擁有純正乳酸香氣，酸度適宜，口感細(xì)膩。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)建立的二次回歸模型準(zhǔn)確有效，可提高復(fù)合發(fā)酵液的品質(zhì)，為開發(fā)新型黑木耳白刺果復(fù)合發(fā)酵飲料提供了新的依據(jù)。