潘冬梅，吳怡瑾，王玉露，李海燕，梅 林

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

硝酸鹽與亞硝酸鹽廣泛存在于食品中，具有發(fā)色、保持風(fēng)味、抗氧化和抗菌等特性，在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中常被用作固化劑和防腐劑[1]。亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質(zhì)，能夠引發(fā)高鐵血紅蛋白癥[2]，在人體內(nèi)與腸胃中的含氮化合物結(jié)合，形成致癌前體物質(zhì)亞硝胺，亞硝胺具有強(qiáng)烈的致癌作用，能夠引起食道癌、胃癌、肝癌和大腸癌等[3]，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的威脅，目前尚未找到能夠完全代替亞硝酸鹽的物質(zhì)，亞硝酸鹽仍是肉制品加工過(guò)程中的最佳選擇[4]，因此對(duì)食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的控制以及降解極為重要。

亞硝酸鹽的降解方法主要為生物、化學(xué)、物理降解[5]，其中生物降解法主要為亞硝酸鹽降解發(fā)酵劑，具有高效、健康[6]、提升肉制品風(fēng)味[7]的優(yōu)勢(shì)，是研究的熱點(diǎn)。生物法最常用的發(fā)酵劑是乳酸菌，乳酸菌在代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)酸、酶以及其他物質(zhì)，從而改變發(fā)酵環(huán)境[8]，達(dá)到高效降解亞硝酸鹽以及生物胺的效果，如植物乳桿菌（Lactobacillus plan-tarum）PL-ZL001可以抑制香腸中6種生物胺的積累[9]；丁娟芳等[10]從揚(yáng)州醬菜中篩選到能降解亞硝酸鹽的高活性乳酸菌DGJ-17。而化學(xué)方法則主要是加入抗氧化劑，天然抗氧化劑包括維生素C（vitamin C，VC）、茶多酚（tea polyphenols，TPs）。茶多酚作為一種天然抗氧化劑，具有高效的抗氧化能力，并且具有一定的降解亞硝酸鹽的效果[11]，王瑩等[12-13]研究表明，茶多酚對(duì)微生物的作用具有選擇性，它能夠抑制致病菌，并且具有保護(hù)和促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的作用，促進(jìn)雙歧桿菌及乳酸菌的增殖，從而參與改善人體微生態(tài)，增強(qiáng)腸道的免疫功能。

本研究以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FQR作為研究對(duì)象，添加茶多酚輔助，以生物降解法結(jié)合化學(xué)降解法降解亞硝酸鹽，對(duì)茶多酚輔助降解亞硝酸鹽的條件進(jìn)行了分析，為乳酸菌發(fā)酵食品中亞硝酸鹽的降解提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FQR：由本實(shí)驗(yàn)室保存[14]。

1.1.2 試劑

MRS肉湯（pH 6.2±0.2）、MRS瓊脂培養(yǎng)基（pH 6.2）：杭州百思生物技術(shù)有限公司；茶多酚（純度≥98.5%）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；亞硝酸鈉、鹽酸、四硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；Lambda 35紫外可見分光光度計(jì)：珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；TL-18M型高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)研究所；DFE-20型精密pH計(jì)：梅特勒一托利多（上海）有限公司；HP-9012恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9030A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒有限公司；LX-B100L立式高壓蒸汽滅菌鍋：廣州康邁醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2SD超凈工作臺(tái)：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；Eppendorf Researchplus移液槍：廣州雷得生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與保存

取保存好的菌株FQR接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次得活化菌株，將培養(yǎng)好的菌株于甘油凍存液中，-80 ℃保存。

1.3.2 茶多酚對(duì)菌株FQR生長(zhǎng)的影響

分別向滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)液添加0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的茶多酚（經(jīng)紫外照射滅菌30 min），以1%的接種量將菌株FQR接種于培養(yǎng)液，置于37 ℃條件下培養(yǎng)，在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)分別取100 μL菌液，稀釋后涂布于MRS平板，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 茶多酚添加量對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

分別向滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)液中加入150 mg/L NaNO2以及不同含量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）的茶多酚，接種1%菌株FQR于培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.4 乳酸菌接種量對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

分別向滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，對(duì)照組不加入茶多酚，分別接種1%、2%、3%、4%、5%的菌株FQR于培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.5 培養(yǎng)溫度對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

分別向滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，對(duì)照組不加入茶多酚，接種3%的菌株FQR于培養(yǎng)液，分別于29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃條件下培養(yǎng)12 h，測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.6 pH對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

分別向滅菌后調(diào)節(jié)不同pH值（3、4、5、6、7）的MRS肉湯培養(yǎng)液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，對(duì)照組不加入茶多酚，接種3%的菌株FQR于培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.7 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[15-17]的方法測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

每組每次至少3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用ANOVA分析，多重比較采用Duncan法，P＜0.05表示差異顯著，用Origin軟件進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)植物乳桿菌FQR生長(zhǎng)的影響

表1 茶多酚添加量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of tea polyphenols additions on the growth of lactic acid bacteria CFU/mL

由表1可知，當(dāng)茶多酚的添加量≤0.2%時(shí)，培養(yǎng)液中的菌落數(shù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，茶多酚添加量為0.2%時(shí)，菌株FQR生長(zhǎng)狀況最佳，表明本研究中茶多酚的添加在一定范圍內(nèi)促進(jìn)了菌株FQR的生長(zhǎng)。蔣玉蘭等[18]研究表明，茶多酚對(duì)植物乳桿菌具有增殖作用。王麗等[13]研究報(bào)道茶多酚有化學(xué)益生素的作用，對(duì)有害菌的增殖起抑制作用的同時(shí)能促進(jìn)有益菌菌群的生長(zhǎng)。表1中當(dāng)茶多酚添加量達(dá)到0.5%時(shí)，菌落數(shù)生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比基本持平，添加量0.6%后菌落生長(zhǎng)情況開始被抑制，王瑩[12]的研究中說(shuō)明茶多酚分子中的眾多酚羥基可與蛋白質(zhì)分子中的氨基或者羧基結(jié)合，茶多酚與蛋白質(zhì)之間的這種多點(diǎn)結(jié)合作用阻止細(xì)菌的侵染，從而使茶多酚具有抑菌作用，且其抑菌的能力與濃度有關(guān)。

2.2 茶多酚添加量對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響

由圖1可知，茶多酚添加量為0.1%～0.3%時(shí)，隨著添加量增加，培養(yǎng)體系中亞硝酸鹽降解率逐漸升高，與空白組的（73.92±1.17）%相比較，添加茶多酚后體系中亞硝酸鹽降解率均顯著提高（P＜0.05），茶多酚添加量為0.3%時(shí)亞硝酸鹽清除效果最好，降解率達(dá)到（83.05±1.48）%，比未添加茶多酚組提高了12.35%。當(dāng)茶多酚添加量增至0.4%時(shí)，培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽降解率為（81.19±0.94）%，與0.3%組相比較低且差異顯著（P＜0.05）。

圖1 茶多酚添加量對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響Fig.1 Effect of tea polyphenols addition on nitrite degradation rate

表1中茶多酚促進(jìn)菌株FQR生長(zhǎng)的最佳添加量是0.2%，而在亞硝酸鹽加入后，清除亞硝酸鹽效果最好的茶多酚添加量是0.3%而并非0.2%。這是因?yàn)樵谔砑恿藖喯跛猁}的培養(yǎng)液中，茶多酚本身作為抗氧化劑具有一定的降解亞硝酸鹽的作用[20-21]，此時(shí)培養(yǎng)液中不僅僅依靠菌株FQR產(chǎn)生的酸和被誘導(dǎo)后產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽[22]，同時(shí)，茶多酚對(duì)培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽也起著降解的作用。

2.3 乳酸菌接種量對(duì)茶多酚輔助降解亞硝酸鹽降解率的影響

圖2 接種量對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響Fig.2 Effect of inoculum on nitrite degradation rate

由圖2可知，添加茶多酚組的亞硝酸鹽降解率均顯著高于未添加組（P＜0.05），接種量為3%時(shí)清除效果最好，添加組為（89.09±0.63）%，比未添加組的（79.96±0.53）%提高了11.42%。接種量為1%～3%時(shí)降解率呈上升趨勢(shì)，而當(dāng)接種量＞3%之后兩組均開始下降，這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大會(huì)造成培養(yǎng)液體系中的營(yíng)養(yǎng)不足，導(dǎo)致菌株的生物量增長(zhǎng)[23]，此時(shí)添加茶多酚組的清除效果仍比未添加組高。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)茶多酚輔助降解亞硝酸鹽降解率的影響

圖3 溫度對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響Fig.3 Effect of temperature on nitrite degradation rate

由圖3可知，添加茶多酚組的亞硝酸鹽降解率均顯著高于未添加茶多酚組（P＜0.05）。在29 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，亞硝酸鹽的降解率較低，這可能是因?yàn)槿樗峋?9 ℃條件下的生長(zhǎng)狀況較差，體系中僅有少量的菌和茶多酚對(duì)亞硝酸鹽的降解起作用。隨著培養(yǎng)溫度的升高，亞硝酸鹽降解率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在37 ℃條件下，與未添加茶多酚組降解率[（78.24±0.28）%]相比，添加茶多酚組亞硝酸鹽的降解率最高，為（88.23±0.59）%，提高了12.77%。

2.5 pH對(duì)茶多酚輔助降解亞硝酸鹽降解率的影響

圖4 pH對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響Fig.4 Effect of pH on nitrite degradation rate

由圖4可知，pH為3～7時(shí)，添加茶多酚組的亞硝酸鹽降解率均顯著高于未添加茶多酚組（P＜0.05），說(shuō)明茶多酚在5個(gè)不同pH的條件下都能夠提高乳酸菌降解亞硝酸鹽的降解能力。添加茶多酚組隨著起始培養(yǎng)pH值的上升，亞硝酸鹽降解率呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，pH為3時(shí)添加茶多酚組培養(yǎng)液中亞硝酸鹽降解率較高，為（82.74±0.44）%，pH為4時(shí)降解率略降低，張慶芳等[24]研究表明，乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)制分為酸降解和酶降解，當(dāng)反應(yīng)體系中pH值＜4.5時(shí)主要為酸降解，pH值＞4.5時(shí)主要為酶降解，因此pH值較低時(shí)亞硝酸鹽降解率較高為正?，F(xiàn)象。當(dāng)pH為5時(shí)降解率最低，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)液pH條件既不適合乳酸菌的生長(zhǎng)，又不能達(dá)到很好的降解亞硝酸鹽的效果。pH為6時(shí)亞硝酸鹽降解率最高，為（89.79±0.57）%，比未添加茶多酚組高10.80%。推測(cè)其原因可能是pH為6較適宜菌株FQR的生長(zhǎng)代謝，能夠產(chǎn)生較多的亞硝酸鹽還原酶，從而提高了亞硝酸鹽降解率。

3 結(jié)論

在一定添加量范圍內(nèi)，茶多酚能促進(jìn)植物乳桿菌FQR的生長(zhǎng)，添加量為0.2%時(shí)生長(zhǎng)狀況最佳。茶多酚的添加能夠提高乳酸菌培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的降解率，由于茶多酚添加量過(guò)多時(shí)會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，因此添加量為0.3%時(shí)培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的降解率最高，比未添加茶多酚組提高了12.35%；進(jìn)一步研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)茶多酚輔助植物乳桿菌降解亞硝酸鹽效應(yīng)的影響，得出接種量為3%時(shí)，亞硝酸鹽降解率最高，為（89.09±0.63）%；培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，亞硝酸鹽降解率最高，為（88.23±0.59）%；起始pH值為6時(shí)，亞硝酸鹽降解率最高，為（89.79±0.57）%。

由此可知茶多酚的加入從兩個(gè)方面影響了亞硝酸鹽的降解，第一方面，茶多酚添加量在一定范圍內(nèi)時(shí)能夠促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，從而能夠提升培養(yǎng)體系中乳酸菌的產(chǎn)酸以及產(chǎn)酶的能力，而乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解就是由培養(yǎng)初期的酶作用和培養(yǎng)后期的酸作用而達(dá)到效果的；第二方面，茶多酚本身作為抗氧化劑能夠通過(guò)催化亞硝酸鹽的還原，進(jìn)而具有一定的降解亞硝酸鹽的能力。目前茶多酚已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用，通過(guò)添加少量的茶多酚提高乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力能夠節(jié)約一定的成本，同時(shí)具有良好的降解效果。