趙 典 張 斌 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京鼓樓醫(yī)院高淳分院消化科2

背景：核糖體RNA加工蛋白15(Rrp15)是一種主要定位于核仁，參與核糖體RNA加工處理的蛋白質(zhì)。關(guān)于Rrp15基因在肝細(xì)胞癌(HCC)中的表達(dá)、功能和臨床意義目前尚未見(jiàn)報(bào)道。目的：探討Rrp15在HCC中的表達(dá)水平及其對(duì)患者預(yù)后和HCC細(xì)胞增殖能力的影響。方法：利用GEPIA網(wǎng)站、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和手術(shù)切除HCC組織標(biāo)本分析Rrp15在HCC中的表達(dá)水平、其表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)預(yù)后的影響。利用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建敲減Rrp15基因的人肝癌細(xì)胞株HuH7，以流式細(xì)胞術(shù)、臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：HCC組織中的Rrp15 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)；Rrp15高表達(dá)者總體生存率和無(wú)病生存率顯著降低(P=0.012, P=0.049)。HCC組織中Rrp15的差異表達(dá)與腫瘤質(zhì)量相關(guān)(P=0.020)，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。敲減Rrp15的HuH7細(xì)胞，細(xì)胞凋亡比例和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高(P<0.05)，細(xì)胞短期和長(zhǎng)期增殖能力均受抑(P<0.05)。結(jié)論：Rrp15在HCC中高表達(dá)并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后相關(guān)。敲減Rrp15基因可顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖能力。

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是主要癌癥相關(guān)死因之一[1]。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，有關(guān)HCC的基礎(chǔ)研究廣泛開(kāi)展，但其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。核糖體RNA加工蛋白15(ribosomal RNA processing 15 homolog, Rrp15)是一種主要定位于核仁、參與核糖體RNA加工處理的蛋白質(zhì)。我國(guó)學(xué)者Dong等[2]發(fā)現(xiàn)，Rrp15參與了包括核仁形成、核糖體生物合成、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控等在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程；敲減腫瘤細(xì)胞株中的Rrp15基因表達(dá)，可阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示Rrp15可能作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。然而，Rrp15基因在HCC中的表達(dá)、功能和臨床意義目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源分析Rrp15在HCC中的表達(dá)水平、其表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)預(yù)后的影響，并通過(guò)敲減人肝癌細(xì)胞株HuH7中的Rrp15基因表達(dá)，觀察其對(duì)HCC細(xì)胞凋亡、增殖等惡性生物學(xué)行為的影響，以期為HCC的Rrp15靶向治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

材料與方法

一、病例資料和數(shù)據(jù)庫(kù)

4對(duì)HCC組織及其相應(yīng)癌旁組織為南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普外科的手術(shù)切除標(biāo)本，采集后30 min內(nèi)液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。研究方案?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入組病例均簽署知情同意書(shū)。

利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis; http://gepia.cancer-pku.cn/)行Rrp15基因表達(dá)水平和預(yù)后分析，利用TCGA(The Cancer Genome Atlas; https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)分析Rrp15基因表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

二、細(xì)胞株和主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HuH7(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)傳代或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

兩種Rrp15基因shRNA(shRNA-Rrp15)慢病毒載體、陰性對(duì)照慢病毒和病毒感染試劑為上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司產(chǎn)品。干擾序列1：5’-GGG AUG GAU GGA AGU ACA ATT-3’，干擾序列2：5’-GGA AAG UGA UGG GCC AGA UTT-3’；陰性對(duì)照序列：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’。

TRIzol RNA分離試劑(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)；ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PMSF(南京生興生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶抑制劑混合物(Roche Molecular Systems, Inc.)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×；Biosharp Life Sciences)；兔抗人Rrp15多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich LLC.)；HRP標(biāo)記抗兔IgG和抗小鼠IgG(Cell Signaling Technology, Inc.)；凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences)；Transwell小室(Corning Incorporated)。

PCR引物由南京銳真生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：Rrp15 F 5’-CTG GGC AGA TGC TAT GGC TAA A-3’, R 5’-GGA CAA CAT CTG GCT TTA CTC TG-3’; β-actin F 5’-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3’, R 5’-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3’。

三、方法

1.慢病毒感染：感染前一天在6孔板中接種HuH7細(xì)胞，24 h后細(xì)胞密度達(dá)30%～50%，參照試劑說(shuō)明書(shū)感染慢病毒，24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.Real-time PCR：慢病毒感染細(xì)胞后第4天，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度，參照試劑說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCT法分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.蛋白質(zhì)印跡法：以RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物配制完全裂解液，裂解組織或慢病毒感染后第4天的細(xì)胞，4 ℃ 12 000×g離心15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，100 ℃ 10 min變性蛋白備用。SDS-PAGE 90 V 30 min，120 V 60 min，PVDF膜濕轉(zhuǎn)200 mA 120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗(Rrp15 1∶250稀釋，β-actin 1∶1 000稀釋)過(guò)夜，洗膜后室溫孵育二抗2 h，洗膜后顯影。Image J軟件分析條帶灰度，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4.細(xì)胞凋亡和活性氧檢測(cè)：慢病毒感染細(xì)胞后第4天，胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基中止消化后1 500×g離心，棄去上清液，PBS洗滌2次，離心后收集細(xì)胞沉淀。參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以結(jié)合緩沖液稀釋Annexin V-FITC和PI(細(xì)胞凋亡檢測(cè))，以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光探針(活性氧檢測(cè))，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡比例和活性氧水平。

5.臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)：慢病毒感染細(xì)胞后第1、2、3、4、5天，胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基中止消化后1 500×g離心，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀，重懸，臺(tái)盼藍(lán)染液室溫染色3～5 min，光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察、計(jì)數(shù)活細(xì)胞個(gè)數(shù)(活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色)。

6.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：慢病毒感染細(xì)胞24 h后，胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基中止消化后1 500×g離心，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀，重懸、計(jì)數(shù)，接種于6孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，每2 d更換一次新鮮完全培養(yǎng)基。14 d后，甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌，光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察、計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Rrp15在HCC中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響

從GEPIA網(wǎng)站納入529例病例資料，其中HCC 369例，正常對(duì)照者160例；HCC組織中的Rrp15 mRNA表達(dá)水平高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖1A)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，4例外科手術(shù)切除HCC組織中的Rrp15蛋白表達(dá)水平高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001；圖1B、1C)。

進(jìn)一步通過(guò)GEPIA網(wǎng)站分析Rrp15 mRNA表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示與Rrp15低表達(dá)者相比，Rrp15高表達(dá)者總體生存率和無(wú)病生存率顯著降低(P=0.012,P=0.049；圖2A、2B)。

T：HCC組織，N：正常/癌旁組織；兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

A：HCC組織和正常肝組織Rrp15 mRNA表達(dá)(GEPIA)；B：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)4對(duì)HCC組織及其相應(yīng)癌旁組織Rrp15蛋白表達(dá)；C：HCC組織及其相應(yīng)癌旁組織Rrp15蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖1 Rrp15在HCC中的表達(dá)

紅色為Rrp15高表達(dá)，藍(lán)色為Rrp15低表達(dá)

二、Rrp15表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

剔除信息不完整的病例后，最終從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)納入135例HCC進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)Rrp15 mRNA在HCC組織中的表達(dá)情況，表達(dá)水平<1定義為低表達(dá)(n=68)，表達(dá)水平>1定義為高表達(dá)(n=67)，分析顯示Rrp15的差異表達(dá)與腫瘤質(zhì)量相關(guān)(P=0.020)，與患者性別、年齡、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、TNM分期和組織病理學(xué)分級(jí)均無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05；表1)。

三、Rrp15基因敲減效率

HuH7細(xì)胞感染慢病毒后第4天，以real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證Rrp15基因敲減效率，結(jié)果顯示與感染陰性對(duì)照慢病毒的對(duì)照組相比，感染shRNA-Rrp15慢病毒的兩組敲減組Rrp15 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1=0.000 1,P2=0.000 1；圖3A)，敲減效率最高達(dá)90%；兩組敲減組Rrp15蛋白表達(dá)水平亦相應(yīng)下調(diào)(圖3B)。

四、敲減Rrp15對(duì)HuH7細(xì)胞凋亡、活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞增殖的影響

流式細(xì)胞分析顯示，敲減Rrp15后，HuH7細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P1=0.000 5,P2=0.000 5；圖4A)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著增高(P1=0.002 5,P2=0.003 0；圖4B)。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減Rrp15可抑制HuH7細(xì)胞增殖，慢病毒感染后第4天(P1=0.005 2,P2=0.000 1)和第5天(P1=0.000 2,P2<0.000 1)抑制效果明顯(圖4C)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，敲減Rrp15可抑制腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力(P1<0.000 1,P2<0.000 1；圖4D、4E)。

表1 Rrp15表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系n(%)

***敲減組與對(duì)照組比較，P<0.001

敲減組與對(duì)照組比較，**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

討 論

HCC是威脅人類健康的重大疾病，盡管近年來(lái)包括分子靶向治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、肝移植等在內(nèi)的多種治療方法都在不斷進(jìn)步[3-5]，但患者5年生存率仍然很低[6]。Rrp15是最早在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的核糖體60S亞基前體的組成部分(Rrp15p)[7]。在人體內(nèi)，Rrp15則同時(shí)為40S亞基和60S亞基前體的組成部分[2]。近年研究表明，Rrp15能促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株NIH3T3增殖，抑制細(xì)胞凋亡[8]；在人宮頸癌HeLa細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)Rrp15基因可致核仁數(shù)量增多，核仁相關(guān)蛋白表達(dá)增高，細(xì)胞增殖速率加快，提示Rrp15可能參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。但迄今未見(jiàn)Rrp15基因在HCC中的表達(dá)及其作用的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)HCC組織中的Rrp15 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，對(duì)4對(duì)外科手術(shù)切除HCC組織及其相應(yīng)癌旁組織中Rrp15蛋白表達(dá)的分析結(jié)果與之相一致；Rrp15高表達(dá)者生存期顯著縮短。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者臨床病理特征的分析顯示，Rrp15高表達(dá)者腫瘤質(zhì)量顯著大于低表達(dá)者。因該數(shù)據(jù)庫(kù)未提供腫瘤大小相關(guān)信息，故本研究納入腫瘤質(zhì)量這一參數(shù)進(jìn)行分析，該參數(shù)可間接反映腫瘤大小，腫瘤質(zhì)量越大、體積越大，增殖能力越強(qiáng)，提示Rrp15在HCC的生長(zhǎng)增殖中扮演極其重要的角色。隨后通過(guò)慢病毒感染成功敲減人肝癌細(xì)胞株HuH7中的Rrp15基因表達(dá)，觀察到細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高，細(xì)胞短期和長(zhǎng)期增殖能力均明顯受抑，表明敲減Rrp15基因能有效抑制HCC細(xì)胞增殖。既往文獻(xiàn)報(bào)道活性氧可激活MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[10-11]。結(jié)合上述研究結(jié)果，敲減Rrp15基因極有可能影響HCC的氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，Rrp15在HCC中高表達(dá)并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為和不良預(yù)后相關(guān)；敲減Rrp15基因能誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，顯著抑制細(xì)胞增殖能力。因此，靶向抑制Rrp15有望成為治療HCC的新方法。然而，HCC中Rrp15基因高表達(dá)以及敲減Rrp15抑制HCC細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制目前仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究，為HCC的Rrp15靶向治療提供更多理論依據(jù)。